二维电泳和质谱技术筛选寻常型银屑病皮损差异表达蛋白

戴逸楠张庆瑞∗姜 奕尹 璐张晓东王恩波陈 洋蔡鑫泽富彦财

二维电泳和质谱技术筛选寻常型银屑病皮损差异表达蛋白

戴逸楠1张庆瑞1∗姜 奕2尹 璐1张晓东1王恩波1陈 洋2蔡鑫泽2富彦财1

目的: 明确寻常型银屑病(psoriasis vulgaris,PV)皮损组织与正常人皮肤中的差异表达蛋白。方法: 收集PV皮损组织及正常人皮肤组织,提取蛋白,进行二维凝胶电泳,选择在PV皮损组织中明显差异表达的蛋白点,进行质谱和生物信息学分析。结果: PV患者角质层和真皮层二维凝胶电泳鉴别蛋白总数分别为(1961±21)和(1928±49)个,确定差异表达蛋白30个,其中14个被鉴定分型:包括角质1型细胞骨架(K1C10、K1C14、K1C15、K1C16)、角质2型细胞骨架(K2C1),肌动蛋白(ARP 3,ACTA,ACTBM),热休克蛋白(PHB,HSPβ1,CH60),中心体蛋白(CP135),膜联蛋白(ANXA4、ANXA5)。结论: 差异表达蛋白可能在PV的病理形成中起重要作用,是潜在的PV诊断标记物。

蛋白质组学； 银屑病； 二维凝胶电泳

近年来,蛋白质组学技术的发展为寻找银屑病敏感、特异的标志物提供了一条有效的途径,1我们采用二维凝胶电泳(two－dimensional electrophoresis,2－DE)对蛋白进行分离,然后利用基质辅助激光解析/电离－飞行时间质谱(MALDI－TOF－TOF－MS)2,3和生物信息学等技术进行鉴定,比较PV患者皮损与正常人皮肤蛋白质表达的差异,以期为PV发病机制的研究及治疗提供有价值的线索。

1 材料和方法

1.1 材料 标本取自我院皮肤科住院寻常型银屑病(PV)患者16例,其中男8例,女8例,同时选取性别、年龄与之匹配的20名健康人(门诊体检者)为对照,其中男10名,女10名。

蛋白质定量双向电泳蛋白质定量试剂盒(GE公司产品),固相pH梯度干胶条(immobilized phgradientIPG3－10,24 cm),电泳试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、尿素、Tris、SDS及CHAPS(Amresco),2D除盐试剂盒(2D clean－up)试剂盒(GE)。质谱鉴定试剂:二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)(GE)、肽标准品及乙腈(默克)、三氟乙酸(TFA)(SIGMA)、基质α－氰基－4－羟基肉桂酸(CCA)及胰蛋白酶(Promiger)。

LEICA激光切割仪(LEICA CTR 6500)、等电聚焦仪(Ettan IpgPphor 3)、大型垂直电泳系统(Ettan DALTsix)、UMAX彩色扫描仪(PowerLook 2100XL)、DeCyder 2D 6.5图像分析软件、EttanSpot Picker挖点仪(GE Health care)、飞行质谱仪(Autoflex IIIBRUKER DALTONOS)、Flex control 3.0质谱信号峰识别软件、Mascot肽质量指纹图数据库查询软件(Matrixscience)。

1.2 方法

1.2.1 提取蛋白 取PV患者皮损和正常人皮肤全层组织,面积为0.5 cm×0.5 cm,生理盐水清洗后－70℃冰箱保存。冰冻组织切片后(16～18μm厚度)置于LEICA薄膜载玻片,LEICA激光切割仪进行组织切割,分别切取角质层组织及真皮层组织,置于0.5 mL离心管。用2D clean－up试剂盒处理样本,提取蛋白。蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。按蛋白浓度不同提取等量蛋白,分为PV患者真皮层组,PV患者角质层组,对照组真皮层组及对照组角质层组,分别取各组各100μL样本,加入凝胶。

1.2.2 双向凝胶电泳(2D－PAGE) 每块凝胶上样100μg蛋白,与水化液(7 mol/L尿素,2 M硫脲,4% CHAPS,0.2%两性电解质)混匀,上样体积为290μL。将IPG胶条(24 cm,pH 3～10,NL)水化后,覆盖矿物油。等电聚焦程序为30 V 6 h→60 V 6 h→500 V 1 h→1000 V 1 h→8000 V 10 h。等电聚焦后,IPG胶条在SDS平衡液(尿素6 M,2%SDS,0.02%溴酚蓝储备液)中平衡15 min。平衡完成后,将平衡后的IPG胶条置于12.5%的均匀聚丙烯酰胺凝胶上方,胶条端滴加宽范围的蛋白标记物10μL,SDS凝胶顶部,用无水乙醇封闭并排除气泡,进行第2向凝胶电泳。电泳参数:功率6 w,直至溴酚蓝前沿抵达胶底边缘为止,总计时20 h。PV患者和对照组的真皮层组及角质层组均采用cy3和cy5荧光染色。图像分析:DeCyder 2D 6.5软件进行图像分析软件分析扫描图像,进行强度校正、点检测、背景消减、均一化和匹配等处理。

1.2.3 酶解及质谱鉴定 选取图像分析得到的差异蛋白质点,切取这些点,脱色后进行胶内酶解,20μg/ L胰酶37℃消化过夜。将提取的肽段溶于以50%乙腈－0.5%三氟乙酸后与等体积饱和基质(CCA)混匀,于不锈钢点靶仪上点样,风干后质谱分析。

1.2.4 蛋白鉴定及数据库查询 在蛋白质序列数据库中搜索肽质量指纹数据,搜索引擎为Mascot(http://www.matrixscience.com),数据库选用SwissProt。参数设置如下:半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl－Cys),可变修饰为氧化(M),每个肽允许有1个不完全裂解位点,肽片段分子量最大容许误差为±100 ppm。蛋白质匹配分数大于36分时有显著性(P＜0.05),确定蛋白名称及功能。

2 结果

2.1 二维凝胶电泳结果 用DeCyder 2D 6.5图像分析软件分析PV患者和正常人角质层和真皮层的二维凝胶电泳结果,蛋白点显示了良好的重复性与稳定性,鉴别蛋白质点数分别为1969±21和1928±49个。将其中一块胶设定为参考胶,组内平均匹配率为78.2%和76.3%。根据匹配的差异表达蛋白点的比值大于2且同组三块胶图谱中都出现相同变化的蛋白带点,视为差异表达蛋白。

表1 PV患者差异表达蛋白质谱结果

2.2 质谱鉴定结果 本研究以PV患者皮损及正常人的角质层及真皮层的蛋白为研究对象,对30个在二维凝胶电泳上的差异表达蛋白进行MANLDI质谱和生物信息学分析,成功鉴定了14种蛋白,分为以下几类:1、角质1型细胞骨架蛋白(K1C10、K1C14、K1C15、K1C16)；2、角质2型细胞骨架蛋白(K2C1)；3、肌动蛋白(ARP3,ACTA,ACTBM)；4、热休克蛋白(PHB,HSPβ1,CH60)；5、中心体蛋白(CP135),膜联蛋白(ANXA4、ANXA5)。其中在PV患者皮损区角质层中高表达的有K2C1、K1C10、K1C16、K1C14、CH60、PHB、ARP3、ACTBM、ACTA、ANAX5、CP135、PHB,低表达的有:K1C15、ANAX4、HSPβ1；PV真皮层低表达的有:K1C16、CP135、ACTA。其中K1C16、CP135、ACTA在PV角质层高表达,真皮层低表达(表1)。

3 讨论

既往有关PV患者血清蛋白质质谱的相关研究,可为PV的发病机制的研究提供一定的科学依据,但是血清蛋白电泳存在血浆中高峰度蛋白对低峰度蛋白掩盖的缺陷,可能对实验结果造成影响。如能直接对PV皮损角质层及真皮层的蛋白进行研究,则能避免该影响,使实验结果更为准确可靠。本实验证明多种细胞骨架蛋白(包括K1C10、K1C14、K1C15、K2C1、K1C16)在PV患者皮损角质层中高表达。Bhawan等4通过免疫组化染色方法研究PV患者皮损区、非皮损区标本及非PV人群正常皮肤标本,发现PV患者皮损K1C16表达增高,与本实验相一致,同时发现在PV患者非皮损区K1C16表达同样升高。因此可将K1C16作为监测临床前PV的标记物。K1C15表达不兼容的角质形成细胞,K1C15表达基因下调才可维持活化表型,5故可通过调控K1C15的表达缩短病程。

膜联蛋白家族是一类结构相关钙依赖性的磷脂结合蛋白超家族,其分布于各种组织细胞中,目前认为它通过调控炎性反应、免疫反应、细胞分化、增殖、凋亡及细胞信号转导等参与细胞各种生命活动。Zimmermann等6通过实验证实在肾髓质肿瘤中ANXA4有可能参与细胞的生长、分化及转化。本研究发现ANXA4在PV皮损角质层中低表达,ANXA4的低表达可导致PV皮损区棘细胞层增殖失控,造成PV皮损区表皮角化过度,形成鳞屑。本实验中ANXA5在PV皮损角质层中出现高表达,ANXA5主要表达于子宫颈癌鳞状细胞细胞质中,随着癌细胞分化从高到低,ANXA5的mRNA水平表达逐渐增高。7随着PV皮损中ANAX5表达的升高,可能导致该处角质层细胞分化降低。

热休克蛋白是所有活细胞在热诱导后能产生的一种高度保守性的蛋白质。正常时在细胞中发挥重要的生理功能,应激时呈高表达,起到应激保护作用。热休克蛋白表达的增加能抑制紫外线诱导的细胞凋亡和皮肤炎症反应。本实验中PV患者皮损角质层中HSP60表达升高,Ishihara8和Hayashi等9均证实掌跖脓疱病患者血清中炎症性淋巴细胞可与HSP60产生免疫级联反应,从而增加PV发病率。

本研究成功利用蛋白质组学技术,建立了PV蛋白标志物的研究平台,初步筛选出K1C10、K2C1、ARP3、ANXA4、ANXA5、HSP60等有可能作为PV标志物的蛋白,进一步为研究PV的发病机制及免疫治疗提供有价值的线索。

1Rana A,MinzRW,AggarwalR,etal.A comparative proteomic study of sera in paediatric systemic lupus erythematosus patients and in healthy controls using MALDI－TOF－TOF and LC MS－A pilot study.Pediatr Rheumatol Online J,2012,10(1):24.

2孙仁山,陈晓红,胡建明.蛋白质组学技术分析银屑病皮损组织中的蛋白质表达.现代医学,20l0,38(2):l44－147.

3尹国华,范星,张开明.体外研究银屑病患者外周血T淋巴细胞对角质形成细胞Ki67、C－Myc及Bcl－xL蛋白表达的影响.中国免疫学杂志,2006,22(12):1150－1157.

4Bhawan J,Bansal C,Whren K.K16 expression in uninvolvedpsoriaticskin:a possiblemarker of pre－clinicalpsoriasis.JCutan Pathol,2004,31(7):471－476.

5Waseem A,Dogan B,Tidman N,et al.Keratin 15 expression in stratified epithelia:downregulation in activated keratinocytes.J Invest Dermatol,1999,112(3):362－369.

6 Zimmermann U,Balabanov S,Giebel J.Increased expression and altered location of annexin IV in renal clear cell carcinoma: apossible role in tumour dissemination.Cancer Lett,2004,209 (1):111－118.

7王立平,李欣,许倩.膜联蛋白A5在人宫颈鳞癌不同分化型的表达及临床意义.天津医药,2012,40(7):648－650.

8 Ishihara K,Ando T,Kosugi M.Relationships between the onset of pustulosis palmaris et plantaris,periodontitis and bacterial heat shock proteins.Oral Microbiol Immunol,2000,15(4):232－237.

9 Hayashi M,Fujihara K,Beder LB.Pathogenic role of tonsillar lymphocytes in associated with HSP60/65 in Pustulosis palmaris et plantaris.Auris Nasus Larynx,2009,36(5):578－585.

(收稿:2013－06－30 修回:2013－10－24)

Identification of differentially expressed p roteins in psoriasis vulgaris using two－dimensional electrophoresis and mass spectrometry

DAIYi-nan,ZHANG Qing-rui,JIANG Yi,et al.People's Liberation Army No.202 Hospital,Shenyang, 110003

Objective:To identify the differentially expressed proteins in psoriasis vulgaris(PV)lesions and normal human skin tissue to propose potential pathologicalmarkers in psoriasis vulgaris.Methods:PV lesions and normal human skin tissues were collected and the proteins were extracted.And then,the proteins were resolved by immobilized pH gradient－based two－dimensional electrophoresis(2－DE).The differentially expressed proteinswere analyzed bymatrix－assisted laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry(MALDI－TOF－TOF－MS)and bioinformation.Results:Well－resolved 2－DE profiles of the epidermal and dermal layer were obtained,and average protein dotswere(1969±21)and(1928±49)respectively；30 differentially expressed proteinswere identified,14 ofwhich were well characterized,including keratin type I, actin,heat shock protein,centrosomal protein and annexin.Conclusion:The differentially expressed proteins may play an important role in the pathogenesis of psoriasis and may be potential biomarkers in the diagnosis of PV.

proteomics；psoriasis；two－dimensional electrophoresis

辽宁省自然基金(编号:20102242)

1中国人民解放军第202医院皮肤科,沈阳,110003

2中国医科大学附属第一医院中心实验室,沈阳,110000

∗通信作者