大白菜中拟除虫菊酯类农药残留半定量ELISA免疫检测方法的建立

文孟棠， 刘 媛， 寇莉萍， 刘贤金

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100;2.江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，江苏 南京210014)

除虫菊酯类农药是一类模拟天然除虫菊酯化学结构合成的农药，具有杀虫谱广、高效、低毒的优点，是目前较理想的农药。近年来，随着一批高毒农药的禁用，菊酯类农药在中国的使用量越来越大，但因其具有化学性质稳定、不易光解、残留期长等特点，在农产品中的残留逐渐引起人们的重视［1］。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)已对它们在蔬菜和水果等上的残留作出了严格限量［2］。中国针对不同农产品中的不同拟除虫菊酯类农药也做了相应的最大残留限量［3］，主要集中在粮油及其制品、蔬果和茶叶上。

目前，定量测定菊酯类农药的方法主要为气相色谱法、高效液相色谱法以及气相色谱-质谱联用［4-5］。但是仪器法对被测样品的净化要求较严格，样品前处理较为复杂，且对仪器设备和检测人员的专业知识要求较高，故不适于现场快速检测［6］。在农药残留的监测体系方面，国际上通行的做法是建立快速筛选和仪器分析相结合的双重监控体制，即在实验室仪器确证分析之前，按一定规范对受检产品取样进行快速检验［7］。免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、分析容量大等优点，不仅可以特异性地针对某单一化合物，还可用于结构相似的化合物，适合于现场快速检测大量样品。

酶联免疫分析法(ELISA)作为目前使用最普遍的免疫检测方式，其效率和灵敏度都得到了广泛认可。针对拟除虫菊酯类农药具有相似结构的特点，以其共性结构的化学合成物作为免疫原制备出的光谱性抗体可同时检测几种农药［8］，使得快速检测的效率显著提高，适合现场检测，因为大多数情况下检测人员只需确定某种类型农药的残留。本试验拟利用实验室自制的抗拟除虫菊酯类的广谱性抗体［9］，优化不同包被抗原和条件，建立对多种拟除虫菊酯类农药的半定量ELISA免疫分析快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

酶标仪(Thermo)，洗板机(Thermo)，酶标板(Corning，96 孔)，移液器(Jencons Sealpette)，超纯水净化仪(Labconco)，分析天平(Ohaus)，氮吹仪(Organomation associates)，固相萃取仪(津腾)，高速分散机(麒麟医用仪器厂生产)，旋转蒸发仪(Labconic)，水浴锅(江苏省东台市电器厂生产)。

1.2 试剂与材料

大白菜(购于苏果超市)，拟除虫菊酯类农药多克隆抗体(本实验室自制)，高效氯氟氰菊酯标准品、甲氰菊酯标准品、氟氰戊菊酯标准品、氰戊菊酯标准品、氯氰菊酯标准品、氯菊酯标准品(农业部农药检定所提供)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Mereker)，环二己基碳酰亚胺(DCC，Mercker)，水溶性碳化二亚胺(EDC，Sigma-Aldrich)，二甲基甲酰胺(DMF，Sigma)，6-氨基己酸(上海化学试剂三厂生产)，硫酸铵(上海化学试剂三厂生产)，四甲基联苯胺(TMB，Sigma)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(武汉博士德公司产品)，H2O2(上海化学试剂公司产品)，SephadexG-10(上海进口分装产品)，卵清蛋白(OVA，Sigma)，牛血清蛋白(BSA，Sigma)，间苯氧基苯甲酸(PBA，Sigma)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 3种包被抗原的合成

活性酯法［10］合成包被抗原1:称PBA 10.00 mg(0.045 mmol)溶于0.3 ml的DMF，加入等摩尔数的NHS5.18 mg(0.045 mmol)、DCC 9.30 mg(0.045 mmol)，充分混匀后室温避光静置过夜。次日10 000 g离心10 min，取上清液缓慢滴加至含10.00 mg(0.000 225 mmol)OVA的5 ml磷酸盐缓冲液(pH 8.67)，反应液在4℃ 1 L PBS(pH 7.4)中透析3 d，得到包被抗原1。透析液用紫外扫描。

用混合酸酐法［11］合成包被抗原2:称取11.00 mg(0.05 mmol)半抗原溶于l ml二氧六环，加入12 μl三丁胺9.27 mg(0.05 mmo1)，待反应液冷却到4℃，再加入 7μl氯甲酸异丁酯 6.83 mg(0.05 mmol)，反应液在4℃下继续搅拌20 min。反应结束后，将混合液滴入10 ml预冷至4℃且搅拌均匀含有45.00 mg(0.001 mmol)OVA的溶液中(水∶二氧六环=1∶1，体积比;pH 9.0～9.5)。加入过程约在15 min左右完成，分别在15 min(pH下降到6.0左右)及1 h(pH在8.0左右)后监控反应的pH值变化，用l mol的NaOH将pH值调到8.5。整个反应时间控制在4.5～5.0 h。反应产物用大量蒸馏水4℃透析3 d，透析液用紫外扫描。

用6-氨基己酸法［8］包被抗原3:先称取6-氨基己酸 6.56 mg(0.05 mmol)、EDC 7.76 mg(0.05 mmol)、OVA 22.5 mg(0.000 5 mmol)溶于水中，调pH至7.5，室温暗中反应18 h后，用SephadexG-10纯化，冷冻，干燥保存。将上述样品溶于含20%DMF的水中，另称PBA 10.7 mg(0.05 mmol)溶于DMF中，慢慢滴加入到上述样品液，然后再加入溶于DMF的DCC 10.3 mg(0.05 mmol)，使DMF最终浓度为30%(体积比)，室温暗中反应18 h，混合物过滤除沉淀后用大量蒸馏水4℃透析3 d，透析液用紫外扫描仪扫描。

1.4 最佳工作条件的确定

采用方阵滴定法确定3种包被抗原和抗体的最佳工作浓度。选择吸光值在1.0左右的抗原抗体稀释浓度作为抗血清及包被抗原工作浓度［12］。设定抗原 浓 度 为 8.000 μg/ml、4.000 μg/ml、2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125μg/ml等浓度梯度，抗体从1∶2 000开始做倍比稀释，用间接非竞争ELISA测定最优工作条件。

1.5 包被抗原的优化

在最优工作条件下用间接竞争ELISA(ICELISA)测定3种包被抗原对各种菊酯农药的抑制情况。以包被抗原1、2、3分别包被ELISA板，每孔100μl，4℃静置过夜，次日用PBS洗板3次，加入1%OVA(质量体积比)，每孔200μl，37℃封闭1 h，PBST洗板3次，加入抗血清和不同浓度PBA及农药标准品各50μl，37℃孵育1 h，PBST洗板3次，加入1∶5 000稀释的二抗，每孔100μl，37℃作用1 h，PBST洗板3次，加入 TMB底物，每孔100 μl，37 ℃ 反应 15 min，2 mol/L 硫酸终止反应，每孔50μl，测定450 nm处吸光值。

1.6 抗原抗体预反应

由于包被抗原和半抗原与抗体的结合能力不同，一般认为大分子的偶联物抗原会优先与抗体发生结合反应，所以须将抗体和半抗原预先混合，使半抗原与抗体充分结合后剩余的抗体再与包被抗原反应，以达到检测的准确性［12-13］。考虑到现场快速检测的要求，针对抗原抗体预先混合反应的必要性做出验证，设置两组试验，一组将 PBA标准品从10μg/ml做系列倍比稀释，然后分别和最优工作条件下的抗体等体积混合，室温过夜。另一组则不预混，按照正常IC-ELISA程序进行，观测两组吸光值的变化。

1.7 抗原抗体反应时间的优化

对于现场快速检测来说，缩短检测时间是非常重要的，故针对抗原抗体反应时间做优化试验。分别设置抗原抗体反应时间为 30 min、45 min、60 min、90 min，按照IC-ELISA方法进行测定，根据450 nm下的吸光值读数计算不同抗原抗体反应时间下的抑制中浓度。

1.8 样品前处理［13］

取大白菜样品可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，切碎后放入食品加工器粉碎，混匀，制成待测样，备用。准确称取20.00 g样品放入打浆瓶中，添加农药标品，加入40.00 ml乙腈，高速匀浆1 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有7.00 g氯化钠的50 ml具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1 min，室温下静置10 min，使乙腈相和水相分层。准确吸取10 ml乙腈相溶液，加到10 ml试管中，用氮吹仪蒸发至干。用甲醇定容，按照试验所需浓度稀释后直接用于ELISA免疫分析测定。

1.9 半定量ELISA应用检测

根据国家标准，这几种菊酯农药在大白菜中的农药限量分别为氟氰戊菊酯0.5 mg/kg、高效氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯菊酯1.0 mg/kg、氰戊菊酯3.0 mg/kg，以此作为试验中各种农药的检测超标限，分别作样品空白对照孔和超标对照孔。结果判断标准:①若样品平均吸光值≥空白对照孔吸光值，则待测样中不含农药;②若超标对照孔吸光值＜待测样品平均吸光值＜空白对照孔吸光值，则待测样中含有农药但未超过限量标准;③若待测样品平均吸光值≤超标对照孔吸光值，则待测样中有农药超标［7］。

取大白菜添加不同剂量的农药样品，添加按前文所述的提取方法，用IC-ELISA对样本进行测定。

2 结果

2.1 包被抗原的紫外鉴定

由图1可以看出，3种方法合成的PBA-OVA的紫外吸收图谱与OVA、PBA相比，吸收曲线发生了明显的改变，3种PBA-OVA在PBA的最大吸收峰296 nm处吸光值都有不同程度的增加，表明3种包被抗原PBA-OVA的偶联是成功的。

2.2 包被抗原的优化

图1 PBA、OVA、包被抗原的紫外扫描图谱Fig.1 UV scanning spectra of PBA，OVA and three different coating antigens

方正滴定法确定3种包被抗原的最优工作条件分别是:6-氨基己酸法，抗体稀释倍数1∶32 000，包被抗原浓度0.250μg/ml;活性酯法，抗体稀释倍数1∶30 000，包被抗原浓度1.000μg/ml;混合酸酐法，抗体稀释倍数1∶12 000，包被抗原浓度2.000 μg/ml。

由图2可以看出，3种不同方法合成的包被抗原在各自的最优工作条件下对PBA和几种拟除虫菊酯类农药的标准品的抑制作用有差异，其中用6-氨基己酸法合成的包被抗原的效果最好，且所用的抗体浓度和包被抗原浓度均是3种包被抗原中最小。这可能是免疫原用的是活性酯法合成的免疫抗原，所以用活性酯法合成包被抗原检测时抗体中针对偶联手臂结构的较多，特异性识别半抗原能力相对变弱;而混合酸酐法是让PBA的羧基形成混合酸酐作为中间体和蛋白质的氨基相连接，虽然是不同的连接方式，但是从紫外图谱可以看出，此偶联物在PBA的特征吸收波长296 nm处吸收值较低，可能是偶联比率太小导致对半抗原识别能力太差。而6-氨基己酸法是用一种新途径合成了一个六碳连接桥，有效避免了对相同手臂的识别，以提高对农药的识别灵敏性，这与骆爱兰等［9］的研究结果相一致。因此选择此种包被抗原用于下一步试验。

图2 不同包被抗原对拟除虫菊酯农药IC-ELISA检测的影响Fig.2 Effects of different coating antigens on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.3 抗原抗体预反应方式优化

由图3可以看出，抗原抗体提前过夜预混与不预混相比，吸光值有相应降低，这可能是抗体在室温放置过夜后活性有些许下降。而两种方式都呈现相同的趋势，并无很大差异，可能是半抗原抗体分子与抗体的反应是在液相中，较固相载体上连接的包被抗原有更充分的接触面积，所以会较快地与抗体结合。所以并不需要经行提前过夜预混处理，这样不仅保持了抗体的活性，而且大大节约了时间成本，更符合现场快速检测的要求。

图3 不同抗原抗体反应方式对拟除虫菊酯农药IC-ELISA检测的影响Fig.3 Effect of antigen-antibody premixing on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.4 抗原抗体反应时间的优化

由图4可以看出，随着抗原抗体反应时间的延长，抑制中浓度有小幅度的下降，从30 min的6.95 μg/ml下降至90 min的5.46μg/ml，即随着反应时间的延长，抗体和抗原的的结合力度更完全更充分。但是对于现场快速检测来说，节约时间是关键，所以选择45 min作为最优反应时间，这样可以达到相对较低的抑制中浓度6.30μg/ml和节约时间的双重效果。

2.5 大白菜基质对于IC-ELISA的影响

选取氟氰戊菊酯作为对象，从图5中可以看出，大白菜基质对IC-ELISA有一定的影响，主要表现为吸光值有一定的下降，但是抗体和氟氰戊菊酯相互作用的趋势却大致类似，所以并不影响半定量ELISA的检测。因此，所用的前处理方法是适用于大白菜的实际快速粗筛的。

2.6 大白菜中几种拟除虫菊酯农药残留半定量快速 ELISA 筛选［14］

图4 不同抗原抗体反应时间对拟除虫菊酯农药IC-ELISA检测的影响Fig.4 Effect of antigen-antibody reaction time on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

图5 大白菜基质对拟除虫菊酯农药IC-ELISA检测的影响Fig.5 Effect of Chinese cabbage on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

共选取5种拟除虫菊酯类农药，分别添加不同的量:0.1 mg/kg、1.0 mg/kg、10.0 mg/kg。每组水平做3个样。同时空白样和各类农药的超标限浓度每一个做10份，取其平均值作为判定标准。考虑到在实际使用农药的时候，可能将不同的农药混合使用，所以选择了高效氯氰菊酯和氯氰菊酯等量混合，以验证农药是否有叠加效应。

由表1可以看出，一共检测了54份大白菜样品，其中假阳性5份，假阴性1份，假阳性率为7.41%，假阴性率为1.85%。对于添加混合菊酯农药的大白菜样品，经过检测后发现有一定的叠加效应，原因是抗体能够识别多种农药，所以在单一农药有限时，多余的抗体会和另一农药结合，但是这个不是简单的相加叠加效应，因为抗体对不同种类的拟除虫菊酯农药的亲和力不同，具体还有待于进一步验证。总的来说作为粗筛方法，可以允许一定的假阳性结果出现，但是假阴性应尽量避免。检测氰戊菊酯时出现了假阴性现象，但在蔬菜中氰戊菊酯超标的情况很少，因此该方法可以适用于大白菜菊酯 农药类实际快速粗筛的检测需求。

表1 半定量ELISA检测大白菜中几种拟除虫菊酯类农药结果Table 1 The pyrethroid pesticide residues in Chinese cabbage detected by semi-quantitative ELISA

3 讨论

ELISA免疫检测方法具有操作简单、不需复杂的样品前处理、需样量少、通量大的特点，目前已有大量的研究报告，但实际应用很少，除了该技术自身存在一些不足，如准确性不如仪器法，重现性太差等，作者认为该技术的定量要求较高也是一个重要原因。作为粗筛方法，半定量ELISA的判定标准是一种简单实用的方法，超标样品可以用仪器法进一步分析。从本试验中对大白菜样品的半定量ELISA的检测结果可以看出，该方法可以同时满足几种拟除虫菊酯类农药的超标初筛，假阳性率很低，能有效防止漏筛;氟氰戊菊酯检测结果出现了假阴性，可能是因为半定量的准确性较低。考虑到实际施药情况的复杂性，对于单个不超标的几种农药混合的情况，可能会判定为阳性结果。因此本试验建立的半定量ELISA检测方法对于大白菜中几种拟除虫菊酯类农药检测具有可行性。

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