新疆汉族、维吾尔族HPV16E6基因变异与子宫颈癌及宫颈病变的关系

古丽娜尔·阿不拉，朱开春，玛依努尔·尼牙孜*，马正海

(1.新疆维吾尔自治区人民医院妇科，新疆乌鲁木齐830001;2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，大量流行病学资料显示，在99%以上的宫颈癌组织中存在人乳头瘤病毒(human Papillomavirus，HPV)DNA，HPV感染是宫颈癌发生的主要并且为始动因素［1］。HPV存在100 多种亚型，其中HPV16 与宫颈癌发病密切相关［2］。HPV16 早期基因区(early region，E 区)、由6 个开放读码框架(open reading frame，ORF)组成，其中E6 是HPV16 主要致癌基因之一。E6 蛋白与抑癌基因P53 结合导致P53 蛋白降解以及生物学功能丧失，从而引起细胞周期紊乱，DNA 损伤积累，最终引起细胞癌变。

将世界范围不同种族，不同人群中分离的HPV16区分为5 种主要的种系发生群［3］。有研究表明［4］，HPV16E6 基因及其编码蛋白的变异与宫颈癌发生有关，不同地区宫颈癌组织中E6 变异株的分布不一致。前期研究指出，新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16E6 基因存在突变［5］，本研究在此基础上，进一步检测新疆汉族、维吾尔族宫颈癌及宫颈病变细胞中HPV16E6 变异株的分布，探讨随病变的加重HPV16E6 变异的变化规律及其在两个民族间的差异。

1 材料与方法

1.1 病例收集

收集从2011年9月至2012年3月在新疆自治区人民医院住院或门诊就诊的汉族、维吾尔族妇女宫颈癌及宫颈病变标本244 例进行凯普基因芯片检测，筛选出HPVl6 阳性病例140 例(汉族65例，维吾尔族75 例)为研究对象。患者年龄22 ～78 岁，中位年龄45 岁。所有标本收集均经患者本人知情同意。

1.2 主要试剂和引物的设计和合成

TaqDNA 聚合酶、dNTP 和DNA marker DL2000(上海生工生物工程技术有限公司)根据HPV16DNA全长序列，利用primer express 软件PE 公司设计跨HPV16E6 整个阅读框的一对HPV16E6 P1:5'-CGT AACCGAAATCGGTTGAAC-3'，P2:5'-GCTCATAACA GTAGAGATC-3'引物，上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 HPV16E6 基因PCR 扩增和序列测定及分析

通过凯普基因芯片技术进行HPV 基因分型，筛选HPV16 阳性标本，用HPV16 阳性细胞DNA 为模板，扩增HPV16E6 基因，PCR 反应条件如下:95 ℃预变性5 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃60 s，35个循环，72 ℃7 min。

1.4 HPV16 E6 基因测序及分析

PCR 产物纯化后，利用HPV16 E6 P1/P2 引物，正反向对PCR 产物直接测序。纯化和测序服务由英潍捷基生物工程有限公司提供。测序结果用DNAMAN(6 .0.3.48)软件进行比对分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS13.0 统计学软件，基因突变率比较均采用χ2检验。

2 结果

2.2 HPV16 阳性标本中HPV16 E6 基因扩增结果

以HPV16 阳性细胞 DNA 为模板，利用跨HPV16E6 整个阅读框引物扩增E6 基因，阳性结果在550 bp处呈现一亮带。140 例HPV16 阳性标本中有129 例扩增出E6 基因11 例未扩增出(图1)。

2.2 HPV16E6 基因测序结果及分析

HPV16E6 基因PCR 产物经过纯化后直接进行双向测序，得到清晰的测序结果123 份(汉族57 份、维吾尔族66 份)，另外6 个样品信号较差，未进行突变分析。将所测序列与HPV16 标准株E6 基因序列进行比较，汉族、维吾尔族宫颈癌及宫颈病变标本HPV16E6 突变率分别为:47.37%(27/57)和50%(33/66)，两个民族标本中共发现8 个基因突变位点:178:T→G(25:D→E)、256:T→C(同义突变)、295:T→G(64:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G (83:L→V)、430:A→G(同义突变)、442:A→C(113:E→D)(数字代表碱基在HPV16 全基因序列中的位置)，E6 变异株在新疆汉族、维吾尔族中的分布以亚洲株和欧洲株为主(表1，图2)。

图1 HPV16E6 PCR 电泳结果图Fig 1 PCR amplification of HPV16E6 gene

2.3 HPV16E6 突变在汉族、维吾尔族各级别宫颈病变之间的分布

发生变异的27 例汉族宫颈癌及宫颈病变标本中主要突变位点分别为178:T→G(25:D→E)、320:A→G(73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、350:T→G(83:L→V)、442:A→C(113:E→D)，在33 例维吾尔族宫颈癌及宫颈病变标本中，主要突变位点分别为350:T→G(83:L→V)、295:T→G(64:D→E)、178:T→G(25:D→E)、320:A→G (73:I→V)、335:C→T(78:H→Y)、442:A→C(113:E→D)，其中L83V 变异株在汉族、维吾尔族突变中占的比例均最高，汉族L83V 突变频率为29.82%(17/57)显著低于维吾尔族的40.90%(27/66)(P＜0.05)，而汉族D25E 突变频率为19.30%(11/57)显著高于维吾尔族的7.58%(5/66)(P＜0.05)。D64E 变异株在维吾尔族中突变频率为6.1%(4/66)，而汉族标本中未检出。E6 基因突变率随宫颈病变的加重均具有增加趋势，在汉族各级别宫颈病变之间无差异，在维吾尔族各级别宫颈病变之间也无差异(表2)。

3 讨论

宫颈癌是严重威胁妇女生命健康的疾病之一，在维吾尔族人群中发病率和死亡率均较高并有年轻化趋势。高危型HPV 持续性感染与宫颈癌发病密切相关，大多数宫颈癌组织中可检测到HPV16 和HPV18，所以HPV16 和HPV18 感染被认为是宫颈癌的主要病因［6］。大多数研究显示，某些特定的HPV16 变异株的感染增加宫颈病变的风险，或其感染与宫颈病变程度有关，相同的变异株在不同地区、不同种族的致癌危险性也存在明显的差异［4］。

表1 HPV16E6 碱基及氨基酸变异Table 1 HPV16E6 nucleotide and amino acid mutation of HPV16E6

图2 新疆汉族、维吾尔族妇女宫颈癌及宫颈病变标本HPV16E6 变异株与参考株E6 蛋白氨基酸序列比较Fig 2 The specimen mutant and reference strains of HPV16E6 amino acid sequence of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur women

表2 HPV16E6 突变在汉族、维吾尔族各级别宫颈病变之间的分布Table 2 HPV16E6 mutation distribution of cervical cancer and cervical lesions in Han，Uygur

HPV 的基因变异、病毒持续和反复感染及宿主免疫状态等因素与宫颈癌的发生密切相关，其中HPV 病毒持续和反复感染可由基因的变异所引起，所以干扰致癌基因E6 的型内变异使P53 蛋白的稳定性增强，具预防宫颈癌的作用［7］。HPV16 E6 基因常发生变异，不同地区流行的变异株也有差异。欧美地区流行的HPV16E6 变异株主要是G350(L83V)，而东亚地区主要是G178(D25E)［8］。研究发现，中国广东地区宫颈癌中HPV16E6 突变株以D25E 为主，还有E113D、H78Y、L83V、F69L［9］。前期研究指出新疆维吾尔族宫颈癌组织中存在HPV16E6 基因突变，突变株以L83V 为主，也有D25E、D64E［5，10］。本研究中，新疆汉族、维吾尔族宫颈癌及宫颈病变标本中HPV16E6 变异株均以L83V为主，汉族L83V 突变频率显著低于维吾尔族中的突变频率，还存在D25E、I73V、D64E、H78Y、E113D的变异株，汉族D25E 突变频率显著高于维吾尔族，汉族标本中未发现D64E 变异株，同时本组汉族、维吾尔族妇女宫颈癌及宫颈病变标本中还存在非洲亚型H78Y 变异株和亚洲亚型E113D，这在前期文献中未报道。在我国新疆地区除了有亚洲型E6 突变外，还有欧洲型和非洲型突变类型，这可能与新疆汉族、维吾尔族种族特异性有关。

目前HPV16 基因突变与宫颈癌的相关性报道，国外研究结论不一，国内报道较少。有研究报道，HPV16 基因350 位T 到G 的突变是宫颈癌的高危因素［11］。本研究结果显示，350 nt、178 nt等位点的E6 基因突变率在两个民族中随宫颈病变的加重均具有增加趋势，但无显著性差异。此结果与一些研究结果不一致［12］。

本研究结果提示，在新疆汉族、维吾尔族妇女宫颈癌及宫颈病变标本中均存在较多的HPV16E6变异株，各变异株在两个民族病样中的分布有差异，维吾尔族标本中L83V 变异株比汉族多并随病变的加重具增加趋势，汉族标本中检出的D25E 变异株多于维吾尔族，汉族标本中未发现D64E 变异株，可能是维吾尔族特异变异株，此结果将为我国不同民族宫颈癌及宫颈病变患者组织中HPV16E6基因变异特点积累流行病学资料，对阐明该区宫颈癌高发原因有一定的意义。

［1］Patricia Dhar J，Lancaster W，Gregoire L，et al．HPV cervical infection and immunodysregulation:synergistic risks for neoplasia-review［J］．Current Women's Health Reviews，2010，6:287－296．

［2］Whyte J．HPV and cervical cancer:Latest developments［J］，Consultant，2012，52:555－560．

［3］Yamada T，Manos MM，Peto J，et al．HPV 16 sequence variation in cervical cancers:a worldwide Perspective［J］．J Viol，1997，71:2463－2472．

［4］Zehbe I，Richard Ch，Decarlo CA，et al．Human papillomavirus 16E6 variants differ in their dysregulation of human keratinocyte differentiation and apoptosis［J］．Virology，2009，383:69－77．

［5］朱开春，玛依努尔·尼牙孜，刘芳，等．新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16 型E6 基因的变异分析［J］．临床肿瘤学杂志，2008，13:209－212．

［6］曾四元，梁美蓉，李隆玉，等．血清SCCA 水平及盆腔淋巴结HPV16/18 感染状况与宫颈鳞癌患者预后的关系［J］．基础医学与临床，2012，32:1167－1170．

［7］李晶华，王伟娟，高婉丽，等．HPV18E6siRNA 对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响［J］．基础医学与临床，2010，30:500－504．

［8］Revilla RL，Pineda MA，Valdez JO，et al．Human papillomavirus type16 variants in cervical intraepithelial neoplasia and invasive carcinoma in San Luis Potosi City，Mexico［J］．Infectious Agents and Cancer，2009，4:1－9．

［9］Cai HB，Chen CC，Ding XH，et al．Human papillomavirus types 16E6 gene variations in Chineses population［J］．EJSO，2010，36:160－163．

［10］马正海，张富春，梅新娣，等．新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16 E6 基因的突变分析［J］．癌症，2004，23:10－16．

［11］Zuna RE，Moore WE，Shanesmith RP，et al．Association of HPV16E6 variants with diagnostic severity in cervical cytology samples of 354 women in a US population［J］．Int．J．Cancer，2009，125:2609－2613．

［12］李清阳，玛依努尔·尼牙孜，阿不力孜，等．新疆南部维吾尔族HPV16E6、E7 突变与宫颈癌、癌前病变的相关性研究［J］．新疆医学，2009，5:1－4．