转基因检测技术与标准物质研究概述

陈锐等

摘 要：转基因技术在农业领域的应用与发展十分迅猛，相应的检测技术体系也在不断更新与进步。本文从检测技术与标准物质两个方面对当前转基因检测技术体系的研究现状和发展趋势进行了概述。

关键词：转基因；检测技术；标准物质

中图分类号：S188 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.03.003

转基因技术在提高作物抗性、增加粮食产量、改善农产品品质以及减少农药使用与污染等方面正深刻改变着现代农业。据统计，2012年全球转基因作物种植面积已达1.7亿hm2，超过全球耕地面积的10%，共计60个国家和地区累计审批1 045项转基因作物用于食品、饲料和环境释放，涉及25个物种、196个转化事件[1]。伴随转基因作物种植面积的激增，关于转基因生物及其产品成分对人类健康和生态环境影响的关注度也与日俱增。

目前国际上在转基因检测与标识管理方面已形成部分共识性文件、评价原则及检测标准，但因不同国家和地区的国情与政策导向不同，转基因产品在标签的阈值范围、标识方式等管理制度上还存在较大差异[2-4]。不同的标识制度直接关系到转基因产品的进出口检验、国际贸易互认等诸多问题，加之公众对转基因食品越来越关注，转基因检测技术近年来得到了快速发展和广泛应用。笔者就转基因检测技术及相关标准物质研究现状进行概述。

1 转基因检测技术概况

转基因检测的对象主要是外源插入基因的核酸序列或其蛋白表达产物。针对蛋白的检测，因其抗体制备成本较高，并且由于外源基因的低水平和时空特异性表达、蛋白的不稳定性，以及多种干扰免疫应答物质的存在，使蛋白检测的应用范围受到一定程度的限制。针对核酸的检测方法灵敏度高、适用范围广，是当前转基因检测的主流方法。按目的转基因检测可分成3个层次：一是通过检测通用的遗传元件来初步筛查样品中是否含有转基因成分；二是针对转化事件的指定特征进行品系特异性鉴定；三是定量分析转基因成分所占比重。

1.1 针对核酸的检测技术

聚合酶链式扩增技术（Polymerase chain reaction， PCR）是目前应用最广泛的转基因检测方法，具有高度特异性和灵敏度，可用于定性或定量分析[5]。PCR法按检测对象可分为元件特异性（如p35S、tNOS）[6]、基因特异性（如cry1Ab，cp4-epsps）[7]、构建特异性[8]和品系特异性4种[9-11]。在标准PCR方法基础上还存在多种改良方法，多重PCR、巢式PCR、半巢式PCR在降低成本、提高通量和灵敏度方面具备优势[12]。反向PCR（Inverse PCR）[13]，热不对称PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）[14]和连接介导PCR（Ligation mediated PCR， LM-PCR）[15-16]在侧翼序列扩增和鉴定方面应用广泛。

定量PCR（Quantitative PCR， qPCR）是目前最有效的转基因定量检测方法，包括竞争定量PCR[17]和实时荧光定量PCR法[18-19]，其中后者利用荧光标记可实时监控扩增过程，根据待测物初始浓度与Ct（Threshold Cycle）值成正比原理，可精确定量靶标DNA。实时荧光定量PCR具有自动化和高精度等优点，但实验成本较高，对操作人员有技术要求，一般需要种间特异、低拷贝的内标准基因或标准物质作为参照。

环介导恒温扩增技术（Loop mediated isothermal amplification， LAMP）是由Notomi等人于2000年建立的一种全新的链置换扩增法（Strand displacement amplification， SDA）[20]。该方法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下完成复杂的扩增过程，产生阶梯状电泳条带，反应结果还可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀或特定荧光染料来判断。LAMP法对仪器依赖度低，具有高效、灵敏、直观的特点，但易出现假阳性，在转基因检测中有一定应用[21-24]。

基于核酸的检测方法还包括核酸印记法（Southern blot）、基因芯片法（Microarray）和生物传感器法（Biosensor）。核酸印记杂交能够精确区分高度同源序列，但对样品纯度要求较高，操作流程繁杂。基因芯片法能够一次性对多种DNA序列进行定性、定量分析，具有高通量和自动化的特点[25]。生物传感器法依赖灵敏的电化学技术，通过固定在传感器表面的特异探针与靶标DNA结合后产生的电信号来检测，是一种高灵敏度的检测方法[26]。

此外，越来越多的新技术正不断的应用于转基因检测领域，包括NASBA扩增技术（Nucleic acid sequence based amplification）[27]、超分支滚环扩增技术（Hyper-branched rolling cycle amplification， HRCA）[28]、焦磷酸测序技术（Pyro-sequencing）[29]、高通量测序技术（High-throughput sequencing）[30]、毛细管电泳技术（Capillary electrophoresis， CE）[31]、高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC）[32]、近红外光谱技术（Near infrared spectroscopy， NIS）[33]和生物条形码技术[34]等。

1.2 针对蛋白质的检测技术

基于蛋白的检测方法主要是以抗原抗体互作的免疫学理论为基础，通过检测外源基因表达的蛋白产物进行测定，主要包括蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immuno-sorbent assay， ELISA）和侧向流动免疫测定法（Lateral flow devices， LFD）[35]。

蛋白质印迹法是检测复杂混合物中特异蛋白的有力工具，它将电泳的高分离能力、抗体特异性和酶的高效催化结合起来，灵敏度可达1～5 ng[36]。ELISA法通过可溶性的抗原或抗体在固相载体上发生免疫反应后，借助比色或荧光反应鉴定目标蛋白，检测灵敏度通常可达0.1%[37-38]。LFD法是广泛使用的试纸条检测法，该方法将特异抗体交联到显色剂和硝化纤维素试纸上，通过观察控制线和检测线的颜色变化来判断检测结果[39]。该方法样品前处理简便快捷，无需特殊仪器，但灵敏度较低，主要应用于田间快检和现场初筛抽查。

1.3 转基因检测数据库

转基因检测相关数据库主要有GMDD（GMO Detection method database）[40]、GMO Compass、CERA、BCH以及ABF等。其中GMDD数据库整合了外源插入基因及其旁侧序列、检测方法、引物序列、协同验证信息、内参基因及有证参照物质等信息，共涉及155种商业化转基因作物品系，是比较全面的转基因检测方法数据库。其他数据库主要收录了转基因相关的技术信息、品系特征、风险评估、产品标识管理和商业化现状等信息。

2 转基因检测标准物质现状

2.1 标准物质的定义

国际标准化组织（ISO）对标准物质（Reference material， RM）的定义是：具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准仪器设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质[41]。标准物质作为实物形式的计量标准，可以是纯的或混合的气体、液体或固体，稳定性、均匀性、准确性和量值溯源性是其基本属性。标准物质按级别一般可分为基准标准物质（Primary reference material， PRM）、有证标准物质（Certified reference material， CRM）和工作级标准物质（Secondary reference material， CRM）。我国将标准物质分为一级标准物质（国家级）和二级标准物质（部门级）[42]。

2.2 我国标准物质的管理

我国最早的标准物质可追溯到1952年的第一批冶金国家标准样品，之后1988年国家标准总局批准成立了全国实物标准委员会，负责标准样品的规范化管理；1996年，国家质量监督检验检疫局批准成立了国际标准样品委员会（ISO/REMCO）中国委员会，负责与国际接轨并根据工作需要成立了冶金、有色金属、环保、农药、气体化学品、无损探伤、酒类等7个分会及多个专业技术工作组[43]。目前，我国的标准物质管理由国家质检总局计量司负责，国家质检总局委托中国计量测试学会组织各行业专家成立全国标准物质管理委员会，制定工作导则与技术规范，并负责标准物质的行政审批和评审考核等工作。

2.3 转基因检测标准物质分类

转基因检测标准物质（Reference material for GMO detection）属于生物标准物质，是具有一种或多种足够均匀并很好确定了相关的特性值，在转基因检测中用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质[44]。目前转基因检测标准物质主要有基体标准物质和DNA标准物质两类，其中后者又可分为质粒DNA、基因组DNA和扩增子DNA3种。由于不同的稳定性、准确度和制备工艺，不同的转基因标准物质在实际应用中各有利弊，其中基体标准物质和质粒DNA标准物质应用范围最广。

基质标准物质是由植物种子或器官研磨加工后混合而成，主要通过重量法进行制备。制备过程一般利用精磨手段来减小颗粒体积差异从而提高均匀性，但此过程又不可避免的会造成DNA降解，目前欧盟开发的冷冻研磨和干样混合技术能有效地解决此问题。此外，植物特异性、组织倍性和亲本特性也是影响基质标准物质均匀性和准确性的重要因素[45-46]。例如，种子的胚、胚乳和果皮的倍性不同，即各组织的DNA含量不同，若制备过程中使用的组织所占比例不同，必然会影响最终结果。质粒标准物质是包含待测目的基因和内标基因的重组质粒分子，可作为标准阳性物质替代物，也可根据分子量换算计算拷贝数，在定量PCR检测中应用广泛[47]。质粒标准物质的量值用DNA质量和转化因子（Conversion factor， CF）表示，并需要通过多家实验室的联合实验来定值。

比较而言，基质标准物质制备成本高，工艺复杂，而质粒标准物质具有廉价、易富集、使用方便和均匀性好等特点，尤其是在阳性物质难以获得的情况下，质粒标准物质具有绝对优势[48]。

2.4 转基因检测标准物质研发现状

目前生产转基因检测标准物质的机构主要有欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements， IRMM），美国的油脂化学家学会（American Oil Chemists Society， AOCS）和日本农林水产省下属的食品综合研究所。

IRMM自1997年以来，根据欧盟标签制度规定的阈值，陆续研发了质量比从0到100%不等的转基因阳性标准物质，其中包括玉米、大豆、马铃薯、甜菜和棉花在内的有证标准物质20余种。AOCS主要生产纯品形式的标准物质，包括油菜、棉花、水稻、大豆和玉米等农作物。日本食品综合研究所与NIPPON公司合作研发转基因标准物质，但产品只在国内使用，不对外销售，目前已制备3种基体标准物质（GTS40-3-2、MON810和GA21）和2类质粒标准物质（大豆和玉米）。目前市场上可售的有证标准物质主要由IRMM和AOCS生产，基体标准物质居多，质粒标准物质较少。

我国转基因标准物质研究相对滞后，农业部已于2011年开展重大专项攻关，建立了包括玉米、水稻、小麦、棉花和大豆在内的基体、质粒和基因组DNA标准物质研制体系，并取得了阶段性成果。此外，上海交通大学[49]、中国计量科学研究院[50-51]、中国检验检疫科学研究院[52]等多家单位也陆续开展了转基因标准物质的研制工作。

3 展 望

随着世界人口增长与粮食短缺的矛盾日益加剧，转基因技术在农业领域的研发和应用前景一片光明。新一代商业化转基因作物性状正趋向多样化、复杂化，转基因食用安全问题也正逐步成为公众热议的焦点，这使得建立快速、精准、高通量的转基因检测体系成为必然趋势。其中，标准物质作为分析测量的物质基础和质量管理工具，其制备技术和应用程度能够直接反应检测技术体系的水平。因此，大力发展符合国情的、科学可靠的转基因检测技术与标准物质，掌握核心技术，抢占领域高地，不仅关乎国家利益，而且对维护转基因产业的良性发展以及保障人类健康都具有十分重要的意义。

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