雪卡毒素产毒藻(岗比亚藻)研究进展*

徐轶肖 江 涛

(1.南京大学地理与海洋学院 南京 210093;2.Biology Department,Woods Hole Oceanographic Institution,USA 02543;3.暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心 广州 510632;4.中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)

雪卡毒素(Ciguatoxins,CTX)是一类富集于珊瑚礁鱼体内的聚醚类化合物,由 13—14个环组成。人类食用有毒珊瑚鱼可引发雪卡毒素中毒(ciguatera fish poisoning,CFP)。雪卡毒素毒性强,是已知的危害性较严重的海洋生物毒素之一,全球每年至少有25000人因食用海产品引起雪卡毒素中毒(Lewis,2001;Friedmanet al,2008)。中毒症状呈多样性,主要取决于食用的毒素量、毒素种类及中毒者敏感性。常见症状包括腹泻、呕吐、腹痛、温度感觉颠倒、肌痛、眩晕、焦虑、低血压和神经麻痹等,其中以温度感觉颠倒最具特征性(Friedmanet al,2008),严重时,症状可持续数月甚至数年,偶见死亡报道(Hamiltonet al,2010)。CFP中毒主要流行于热带、亚热带的加勒比海、太平洋、大西洋和印度洋等海域。随着全球珊瑚鱼贸易的增加,CFP中毒不可避免成为一个全球现象,例如香港的 CFP中毒事件多由进口的南太平洋珊瑚礁有毒鱼引起(吕颂辉等,2006)。

雪卡毒素前驱物为岗比毒素(gambiertoxin),由底栖小型甲藻—岗比亚藻属(Gambierdiscusspp.)产生。Randall(1958)提出著名的食物链假说,指出雪卡毒素可能来源于热带海洋中的底栖藻类,毒素通过食物链传递给鱼类,食物链级别较高的大型鱼类毒性最强。之后,科学家们从海鳝中首次分离获得雪卡毒素(Scheueret al,1967)。1977年,日本与法国联合在太平洋岗比岛(Gambier Islands)证实了致毒藻Diplopsalissp.的存在(Yasumotoet al,1977)。Adachi等(1979)指出该藻为一新属,将之重新命名为Gambierdiscus toxicus。岗比亚藻是单细胞藻类,主要营底栖附生,分布于热带、亚热带及温带水体(图1)。与开放水域能形成赤潮的甲藻不同,它们并不形成水面藻华,而是附着于大型藻或者硬质死亡珊瑚表面(图1)。

二十世纪 80年代末,科研工作者确定了岗比亚藻体内岗比毒素 GTX-4B和海鳝中对应雪卡毒素P-CTX-1的化学结构(Murataet al,1989,1990)。之后陆续在岗比亚藻体内发现其它雪卡毒素前驱物及其同族化学物(Satakeet al,1993,1997)。岗比亚藻除产生脂溶性岗比毒素,还产生另一类水溶性毒素:刺尾鱼毒素(maitotoxin,MTX)、岗比酸(gambieric acid)和gambierol,其中刺尾鱼毒素是目前发现的毒性最大的非蛋白质毒素。由于岗比亚藻产生的水溶性毒素具有水溶性、低口服毒性的特点,一般认为它们不在鱼体内累积,因而对CFP中毒事件贡献甚微。岗比亚藻产生的岗比毒素经食物链传递、积累和代谢后,毒素极性增加,毒性逐渐增强。例如,当GTX-4B转化成P-CTX-1时,毒性增强10倍(Murataet al,1990)。

图1 附着在基质藻上vs.单细胞的岗比亚藻Fig.1 Light microscope photos of epiphytic and single cell Gambierdiscus sp.

与全球有毒有害藻华发展趋势一致,受环境因素和人类活动影响,雪卡毒素中毒事件亦在扩大。雪卡毒素产毒藻成为国际上底栖微藻领域的研究热点之一。自 1977年发现岗比亚藻后,该藻的分类学研究主要基于超微结构和形态学特征(light microscope,SEM)。具体依据有:细胞大小与形态、甲板大小、形状及排列方式。岗比亚藻的细胞外形有球形和背腹扁平两种类型,目前报道的种类多属于后者。上述分类方法的分辨率有限,对背腹扁平种类的正确识别存在较大困难,较易发生种类误定的情况(Holmeset al,2002)。先前针对该藻的生物学、生理学、生态学、毒理学诸多研究中,G.toxicus可能包含数个种,对株的阐述则可能实际上反映了种水平上的差异(Richlenet al,2008;Litakeret al,2010)。目前,一些分子生物学方法(LSU rDNA基因)在该藻的分类学研究中已有成功应用(Chinainet al,1999),结合形态学特征,可确保种类鉴定的准确。因此,有学者建议在此基础上开展种类修订工作,对早期研究结果进行二次研究和修订补充(Litakeret al,2010;Parsonset al,2012)。我国地处太平洋西岸,纵跨热带、亚热带和温带海域,有着漫长的海岸线和众多岛屿,是西加鱼毒多发区域(华泽爱,1994)。早在20世纪70年代,我国南海诸岛、广东沿岸、东海南部、台湾被证实20余种肉毒鱼含雪卡毒素(伍汉霖等,1977),最近中国南部沿海再次检测到染毒鱼(徐轶肖等,2012)。相应地,在西沙群岛附近、香港水域样品中检测到岗比亚藻(陈国蔚,1989;Luet al,1999),并在广东大亚湾、大鹏湾水域发现了岗比亚藻休眠孢囊(Wanget al,2013)。但是,国内有关岗比亚藻生理生态及毒性的研究尚未见报道。本文归纳了雪卡毒素产毒藻—岗比亚藻的分类与分布、生理生态学和毒理学等方面的主要研究结果,并对今后的研究提出展望,为我国开展相关研究提供参考。

1 种类与分布多样性

目前共发现11种8核糖核酸型岗比亚藻(Xuet al,2014)。 除G.ruetzleri与G.yasumotoi为球形外,其余藻种均为背腹扁平型。其中,G.carpenteri和G.caribaeus已确认为全球广布种,G.carolinianus、G.ruetzleri、G.excentricus、Gambierdiscussp.ribotypes 1—2目前为止仅在大西洋分离到,G.australes、G.pacificus、G.polynesiensis、G.toxicus、G.yasumotoi、Gambierdiscussp. types 1—3则仅在太平洋分离到(Kunoet al,2010;Litakeret al,2010;Fragaet al,2011;Nishimuraet al,2013)。Leaw等(2011)在马来西亚海水中发现了G.belizeanus,伍兹霍尔海洋研究所Anderson实验室亦从2011年的基里巴斯Marakei岛样品内检测到G.belizeanus(未发表数据),这表明原来认为仅在大西洋分布的G.belizeanus可能全球均有分布。随着世界各地对雪卡毒素研究力度的增加,可以预见将有更多新种被发现,不排除先前认定的区域种实为广布种。我国的G.toxicus只进行了形态学鉴定,缺乏基因学方面信息(陈国蔚,1989;Luet al,1999),分类正确与否,有待考证。多位学者建议,需将岗比亚藻形态学方面的显性特征与基因方面的隐性特征综合,分类结果方才可靠(Litakeret al,2010;Parsonset al,2012)。因此有必要在雪卡毒素流行区重新进行岗比亚藻鉴定,进一步明确该藻的种类多样性与分布区域。

Juranovic等(1991)认为,岗比亚藻主要分布于纬度 35°N—35°S的热带、亚热带地区,但最新数据显示,分布区间已扩大至纬度35°N—37°S(Parsonset al,2012)。多个地区如东大西洋Canary Islands、西墨西哥湾、东地中海等均记录到雪卡毒素中毒病例,并发现有毒鱼和岗比亚藻(Pérez-Arellanoet al,2005;Benturet al,2007;Villarealet al,2007),证实了雪卡毒素流行区域扩大的事实。该现象可能与全球变暖、人类活动密切相关。升高的海水温度导致珊瑚白化死亡,裸露的珊瑚礁基层有利于基质大型藻生长,最终使岗比亚藻附着于基质藻上繁生。Chateau-Degat等(2005)发现在南太平洋的塔希提岛,岗比亚藻丰度与海水温度正相关。若按照0.028ºC/年的海水升温速度,太平洋夏威夷岛附近水体中的G.caribaeus密度在十年内可增加9倍(Parsonset al,2010)。人类活动诸如码头建设、海油开采、污水排放和富营养化均会破坏珊瑚礁生态系统,从而产生有利于岗比亚藻生长的环境,例如在墨西哥湾的石油开采平台与海上人造礁内均检测到一定量的岗比亚藻(Villarealet al,2007)。通常情况下,岗比亚藻在水体中呈低种群密度,类似藻华密度的岗比亚藻在水体中呈斑块状分布,具不可预见性,这无疑给雪卡毒素的预报和防治增加了困难。

2 生理生态学

岗比亚藻的生理生态学得到了较好研究,总的来说,其有利生长条件如下:充足的附着基质如大型藻、草皮状藻类;水温 21—31°C,最佳区间 25—29°C;高盐度且盐度稳定;浅水体(<50m),光照<10%太阳光;水体扰动低到中程度;充足营养盐。生长条件具体到种/株存在区别。水体中岗比亚藻丰度增加是雪卡毒素中毒事件发生的必要非充分条件。就小尺度而言,该藻生长取决于环境因素与内在因子的相互作用。大尺度导致高丰度岗比亚藻(>1000cell/g)的机理不甚了解。通常认为持续的水体高温与岗比亚藻大量繁殖并引发 CFP中毒密切相关。下面就主要因子进行综述。

2.1 与基质藻的关系

珊瑚礁遭受干扰与破坏时,新裸露的表面被某些机会主义大型藻占领。这些大型藻类是岗比亚藻的理想附着基质,主要包括了红藻门、褐藻门、绿藻门和蓝藻门等 4门 56藻属。另外,科研工作者还在 2蓝细菌属、1硅藻属和 1海草属中发现岗比亚藻(Tindallet al,1998;Cruz-Riveraet al,2006)。岗比亚藻对大型基质藻具有选择性,即偏好具良好三维结构,柔韧性佳,表面积大的基质藻(Lobelet al,1988;Bomberet al,1989a),例如在绿藻Chaetomorpha记录到目前为止岗比亚藻的最高密度为 75793cell/g藻体(Carlson,1984)。岗比亚藻通过黏液膜形成的包被附着在大型藻体上,当受外界因素干扰如水体扰动、光照改变时,部分藻细胞可脱离基质藻呈浮游状态(Nakaharaet al,1996)。所以,严格意义上说,岗比亚藻非完全营附着生活。除了作为附着基质,大型藻还可为岗比亚藻的生长创造有利条件,如为岗比亚藻提供生长所需的营养物质(Steidinger,1983);在浅水体能够遮蔽阳光直射,避免光照过强对岗比亚藻生长产生的抑制(Villarealet al,2002)。

不同基质藻对雪卡毒素在食物链传递过程中的作用不同。在珊瑚礁生态系统,为了应对草食动物的摄食压力,藻类进化出复杂的应对机制减少或避免被摄食,如快速生长、低营养价值、化学物质或结构机制防御、及多种防御机制共同作用。大型基质藻适口性差异造成了大型藻-岗比亚藻共同体在雪卡毒素食物链传递中扮演截然不同的角色:毒素源(toxin sources)或毒素汇(toxin sinks)。例如,快速生长适口性良好的藻类如丝状藻,即使附着其上的岗比亚藻丰度低,也可向食物链提供高通量的雪卡毒素;相反,那些普遍存在的适口性欠佳的基质藻,即使栖息大量岗比亚藻,由于难以被摄食者捕食,对雪卡毒素食物链传递贡献甚微(Cruz-Riveraet al,2006)。因此,在雪卡毒素产毒藻生态学研究中,除考虑岗比亚藻种群密度外,还需考虑适口性与非适口性大型藻的比例及大型藻捕食者类型等因素。

2.2 与环境因子的关系

岗比亚藻的生长受温度条件控制,温度如过高或过低均不利于其生长,但具体的适应温度和最佳温度因种/株而异。Tester等(2010)在温度 18—33°C范围内对6个岗比亚藻种的生长情况进行研究,结果表明:G.caribaeus的最佳生长温度最高(33°C),G.carolinianus最佳生长温度则最低(25°C);当温度低于 21°C 时,G.belizeanus、G.pacificus和Gambierdiscus.sp.ribotype 2均不能存活;当温度高于32°C时Gambierdiscus.sp.ribotype 2死亡。Parsons等(2010)对G.caribaeus(BIG79)的研究显示,当温度低于26°C或高于 29°C时,该藻生长受限。由此可见,温度对不同种/株的岗比亚藻生长影响显著。考虑到种/株间最适生长温度和极限温度的差异,可以预见当海水温度上升时,某些种/株生长将被促进,其它某些种/株则可能受抑制。另外,某些暖水藻种/株,由于同时能够耐受较低温度,表明其可能在较冷水体季节性繁生。雪卡毒素产毒藻对温度适应的差异,是藻株地理分布差异与种群密度周期性变化的重要原因之一。

岗比亚藻的生长也受盐度影响,盐度 28—35适合多数岗比亚藻生长,但具体的适应盐度和最佳盐度,因种/株而异。Yasumoto等(1980a)发现岗比亚藻株在盐度低于27和高于42条件下几乎不能生长,在盐度34时生长最佳。与此相似,Bomber等(1988a)发现,岗比亚藻株在盐度25和40时,生长率显著下降,32生长最佳。近年来,在该藻种的层面上研究表明不同种对盐度响应存在差别,G.caribaeus的最佳盐度为30;G.belizeanus和G.caribaeus在盐度低于17时死亡;盐度低于30时,G.belizeanus生长速率显著降低(Parsonset al,2010)。推测受陆源排水影响的珊瑚礁生态系统,那些适应低盐的藻种/株可能胜出,而在泻湖,适应高盐的藻种/株则有可能占领该系统。

岗比亚藻喜低光照强度,其生长上限约为 10%的太阳光强度,高光照抑制岗比亚藻生长甚至导致死亡。水质良好的热带海域1—4m为最佳生长水深,低于0.5m时,光照高达6.5×104lux,岗比亚藻不能生存(Carlson,1984;Bomberet al,1988a)。自然环境中的庇护体如空间结构良好的大型基质藻有利于岗比亚藻躲避高光强。不同岗比亚藻种/株对光照适应存在差异,例如藻株GT600和GT600A在225—232µmol photon/(m2·s)生长速率最大,而藻株 MQ-1 在 81µmol photon/(m2·s)生长受限(Bomberet al,1988b;Mortonet al,1992,1993);G.caribaeus(BIG 79)在高于150或低于 76µmol photon/(m2·s)时,生长均受限(Parsonset al,2010)。但是,实验室培养岗比亚藻还需考虑光源,使用太阳光或冷白荧光灯管培养藻细胞,光强为3%—4%太阳光时,生长最佳;而用 Vita-Lite灯管培养细胞,最佳光强为 8%—10%太阳光(Tindallet al,1998)。

2.3 与营养盐的关系

岗比亚藻生长与营养盐的关系尚不明确,目前仅有少数研究涉及且结论各异。Yasumoto等(1980b)对法属波利法尼亚水体中的岗比亚藻进行了研究,结果表明该藻密度与无机磷、总磷、硝酸盐、亚硝酸盐、硅酸盐、铁盐、溶解有机碳、维生素B12等浓度无关。与此相似,相同的岗比亚藻株在 N︰P=(5︰1)—(50︰1)培养条件下生长率无显著性差异(Sperret al,1996)。但是,Carlson(1984)指出英属和美属维京群岛的磷酸盐、硝酸盐浓度与岗比亚藻种群密度正相关。最近研究发现,不同氮源不影响实验室培养株G.caribaeus(CCMP1651)生长,但铵盐作为氮源时,Gambierdiscus.sp.ribotype 2(CCMP1655)生长速率显著高于其它氮源(Lartigueet al,2009)。分析营养盐与岗比亚藻的关系取决于水体中营养盐的浓度和藻种/株对营养盐的需求,当浓度满足生长需求,两者无关,当水体中某些营养盐低于生长需求时,显示正相关。

结合目前生理生态学领域取得的进展,下一步研究需继续探索岗比亚藻与附着基质藻、摄食者之间的关系;明确温度、盐度、光照和营养盐浓度等因素对岗比亚藻种水平生长与分布策略的影响;并结合当前环境变化的趋势,阐述全球变暖、海洋酸化对岗比亚藻生长和CFP爆发的影响。

3 毒理学

岗比亚藻能够产生两类毒素:脂溶性和水溶性毒素。前者通过鱼体内的细胞色素酶被氧化成雪卡毒素,后者由于其水溶性特点,传统上认为不在鱼体内富集。草食性鱼类通过摄食岗比亚藻附着的基质藻,积累岗比毒素并将之转化为极性较低的雪卡毒素,肉食性鱼类通过摄食草食性鱼类将毒素进一步代谢成极性增加、毒性增大的毒素。不同岗比亚藻种/株的产毒能力(毒素成分、毒性大小)不同,从源头上解释了加勒比海、太平洋、大西洋、印度洋地区间染毒鱼体内的毒素成分、人体中毒症状迥异,以及岗比亚藻种群密度与CFP中毒事件并非总是正相关。岗比亚藻产毒能力由内在和外在因子共同驱动,总的来说,种间产毒差异较种内差异、环境因子引起的差异显著。

3.1 种内和种间差异

之前研究中(主要在2009年之前,参考Litakeret al,2010),岗比亚藻种的分类方法尚不完全明确,该藻多以剧毒岗比亚藻(G.toxicus)或Gambierdiscussp.命名,不能很好明确目标藻毒性是针对藻种还是藻株水平的差异。但可以确定的是,不是所有的岗比亚藻都能检测到类似雪卡毒素毒性,不同种/株之间产毒差异极大,有些藻种/株间毒性差异高达 100倍(Babinchaket al,1986)。随着岗比亚藻在种级别上分类的日趋成熟,科研工作者对不同岗比亚藻种/株间的毒性研究发现:最先被发现并命名的G.toxicus毒性很低或未检出毒素,G.toxicus和G.caribaeus为低毒性种;G.australe、G.belizeanus、Gambierdiscus.sp.ribotype 2、G.pacificus为中等毒性种;G.polynesiensis和G.excentricus为高毒性种(表1)。岗比亚藻毒性存在明显的种内和种间差异,总体而言,后者显著大于前者。尽管检测方法不完全一致,该藻种内毒性差异基本在 1个数量级内,而种间差异可达 3个数量级,例如太平洋水域的G.polynesiensis毒性是G.toxicus的1147倍(表1)。这与Holmes等(1991)的观点即岗比亚藻的产毒能力可能由基因决定相吻合,从而解释了加勒比海和太平洋的岗比亚藻丰度与毒性无关现象。自然水体中,多种产毒能力不同的岗比亚藻种/株共存,种群组成必然影响岗比亚藻群落的毒性及雪卡毒素的食物链传递。目前有关不同岗比亚藻种/株毒素和毒性的研究尚不够深入,例如仍缺乏G.carpenteri、G.carolinianus、G.ruetzleri、G.yasumotoi、Gambierdiscussp.ribotypes 1的毒素及毒性信息;同时,随着新种/株的不断发现,更多不同地理来源的藻种/株的毒素特征亟待分析。

3.2 环境因素对产毒的影响

研究表明,环境因素(温度、光照和营养盐等)能够影响岗比亚藻细胞水平的产毒能力,但结论并不一致(Lechatet al,1985;Durand-Clement,1986;Bomber et al.,1989b;Mortonet al,1993)。不同培养条件如温度、盐度和光照可使藻株毒性差异达 200倍(Mortonet al,1993)。Bomber等(1988a)指出岗比亚藻在较高温度(27°C)培养下毒性高于较低温度(21°C),而Durand-Clement(1986)认为温度变化不影响产毒。另外,Morton等(1993)提出,毒素产量与岗比亚藻色素合成及光合作用正相关;而Bomber等(1989b)则发现毒素含量与叶绿素a和c2负相关,即高产毒株的叶绿素含量低于低产毒株。细胞毒性与纬度呈负相关,即低温、低光照的高纬藻株毒性低,高温、高光照的低纬藻株毒性高(Bomberet al,1989b)。

水体营养盐浓度和结构也是影响岗比亚藻产毒的重要因素。Lechat等(1985)认为,营养盐丰富的培养基增加藻株产毒量。不同营养条件下,G.caribaeus与Gambierdiscussp.ribotype 2可分别产生1.3—8.7、30.7—54.3fg C-CTX-1 eq/cell(Lartigueet al,2009)。无毒岗比亚藻株在P限制时(N:P>30)开始产生毒素,但相关机理尚不明确(Sperret al,1996)。毒素合成可能与细胞内磷利用有关。岗比亚藻自然藻株比培养藻株毒素产量高100倍(Holmeset al,1991),不知是否因为培养基营养成分富足,而自然水体很可能因为磷限制从而促进藻株产毒的缘故。但 Holmes等(1991)对 2株产毒岗比亚藻和 11株无毒藻研究发现,改变培养基营养成分不影响藻株是否产毒,也不影响产毒量。由此可见,环境因素对不同岗比亚藻种/株产毒的影响不尽一致。目前国内外在该领域的研究尚不够全面和深入,亟需对更多不同地理来源的种/株开展多水平研究。

3.3 其它因素对产毒的影响

岗比亚藻的生长率和生长阶段影响产毒。生长缓慢的岗比亚藻种细胞毒性更大(Chinainet al,2010)。从进化角度理解,有毒藻产生的毒素能够降低捕食压力或通过对其他生物的化感作用,利于生长缓慢藻种的生存。岗比亚藻在不同生长阶段的产毒能力存在差异,普遍认为处于指数生长后期和稳定生长期的岗比亚藻细胞毒性高于指数生长中期的细胞毒性。例如以硝酸盐为氮源时,G.caribaeus(CCMP1651)在平台期的毒性大于指数期;而Gambierdiscussp.ribotype 2不论在何种氮源(硝酸盐、铵盐、尿素、自由氨基酸混合、腐胺)条件下,均显示该规律(Lartigueet al,2009)。但也有学者提出不同结论,即生长阶段对藻毒性无影响(Durand-Clement,1987)。

毒理学方面需深入开展岗比亚藻种内与种间的产毒特征研究,包括产毒与否、毒素成分和毒性大小研究,以及生长条件对产毒的影响,该藻的批量培养及岗比毒素纯品制备。运用岗比亚藻细胞层次毒理学研究结果,进而开发用以野外现场作业的雪卡毒素监控与管理系统。

4 研究展望

相比国际上岗比亚藻在种类与分布多样性、生理生态学、毒理学等领域取得的进展,我国有关岗比亚藻和雪卡毒素的研究尚较薄弱。现有数据业已证实岗比亚藻在我国热带、亚热带海域广泛存在,且在我国海域热带鱼体内多次检出了雪卡毒素,因此有关雪卡毒素及其产毒藻的研究应该受到重视。建议从以下几个方面开展工作:(1)从基础研究入手,通过野外采集大型基质藻,实验室进行岗比亚藻的分离、鉴定、培养并建立藻种库;(2)开展实验室条件下的生理生态学、毒理学研究,探索生长条件如温度、盐度、光照等因子对我国岗比亚藻种/株的生长和产毒影响,筛选有毒种/株及有利产毒条件;(3)进行全面、长期的野外与市场调查工作,弄清我国岗比亚藻分布与雪卡毒素染毒鱼之间的关系,为雪卡毒素中毒事件防治提供生态学和有毒鱼数据支持。

表1 岗比亚藻种内与种间类似雪卡毒素毒性大小比较Tab.1 Comparison among inter-and intra-species Gambierdiscus spp.in CTXs-like toxicity

致谢感谢南京大学邹欣庆老师和伍兹霍尔海洋研究所Anderson实验室的Donald Anderson、Mindy Richlen、Judy Kleindinst、Dave Kulis在雪卡毒素研究中提供的指导和帮助！

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