酶抑制率法在4种蔬菜农药残留快速检测中的应用

2014-03-13刘亚平张金艳孙东立

安徽农业科学 2014年2期

刘亚平，张金艳，孙东立

(1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江胜利农场农业中心，黑龙江饶河 156324；3.黑龙江八一农垦大学理学院，黑龙江大庆 163319；4.黑龙江农垦科学院测试化验中心，黑龙江佳木斯 154000 )

近年来，农药在蔬菜上使用呈逐年增加趋势，但是蔬菜农药残留成为不容忽视的问题。我国目前在蔬菜生产中使用的农药主要有有机磷农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药、苏云金杆菌(Bt)系列农药、阿维菌素系列农药、昆虫激素类农药等。从2007年1月1日起我国已经全面禁止甲胺磷、久效磷、甲基对硫磷、对硫磷、磷胺5种高毒剧毒农药在蔬菜上的使用。蔬菜生产中禁止使用的农药品种有三氯杀螨醇、杀螟威、氧化乐果、甲基异硫磷、水胺硫磷、甲拌磷(3911)、马拉硫磷、速灭威、呋喃丹等；蔬菜生产中限制使用的农药品种有：灭多威(万灵)、敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、乐果、克螨特、乙酰甲胺磷等。

在这种形势下，蔬菜农药残留的趋势是禁用农药残留较少见，而非禁用农药残留超标问题突出。有机磷急性中毒可以导致生命危险,长期低剂量接触或食用有机磷污染的食品对人体潜在危害大。由于剧毒有机磷农药被限制生产和使用，毒死蜱、敌百虫作为它们的替代品，使用量正逐年增加。虽然毒死蜱相对其他的有机磷农药毒性低，但是近年来，关于其对人体和环境的安全性问题越来越引起人们的注意[1]。敌百虫导致人类中毒以及其慢性毒性作用已有报道，超量使用容易发生急性中毒,长期食用会形成慢性中毒,甚至致癌、致畸，是强污染农药之一[2]。

农药残留快速检测技术主要有酶抑制率法、生物传感器法和免疫法等，在我国应用最多的是酶抑制率法[3]，是检测这两类农药残留是否超标的主要方法。但是，该种检测方法易出现假阳性现象干扰检测结果，如韭菜、生姜、大蒜等有刺激气味蔬菜或某些特殊蔬菜，如生菜等。王亚飞等[4]对韭菜滤液进行 80 ℃加热20 min处理，桑园园等[5]对4种辛辣蔬菜蒜苗、蒜黄、大蒜、韭菜提取液分别进行110、100、120、 80 ℃加热处理，消除假阳性。笔者采用酶抑制率法对胜利农场的蔬菜农药残留情况进行检测，旨在为准确检测蔬菜农药残留提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料黑龙江省胜利农场区域内温室大棚及露地种植的常见蔬菜，如黄瓜、豆角、小白菜、小油菜、芹菜、香菜、茄子、甘蓝、大白菜、萝卜等；市场上秋冬季南方蔬菜，如韭菜、黄瓜、辣椒、大葱、生姜、甘蓝、芹菜等。T6S紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；生化培养箱SHP-250；电子天平：可读性精度0.01 g；移液枪：2～100 μl，1 000～5 000 μl；其他玻璃仪器。磷酸盐缓冲液(pH=8.0)，乙酰胆碱酯酶，碘化硫代乙酰胆碱，5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB)。90%敌百虫(湖北沙隆达股份有限公司)；40%氧化乐果乳油(杭州金瑞丰生物科技有限公司)；3%呋喃丹颗粒剂(邢台市农药有限公司)；480 g/L毒死蜱乳油(美国陶氏益农公司)。

1.2方法选取代表性的蔬菜样品，用纸擦去表面泥土，叶菜类剪成1 cm左右见方的碎片，果菜从表皮至果肉1.0～1.5 cm处取样。称取样品2 g，放入150 ml三角瓶中，加入缓冲液10 ml，震荡1～2 min过滤。吸取滤液2.5 ml加入0.1 ml酶液，0.1 ml显色剂，摇匀后放入37 ℃恒温箱中抑制15 min，然后加入0.1 ml底物摇匀后立即放入分光光度计，记录3 min吸光度变化值。检测结果按公式计算：抑制率 (%)=[ (DA0-DAt)/DA0]×100 ，式中：DA0为对照溶液反应3 min吸光度的变化值；DAt为样品溶液反应3 min吸光度的变化值；结果以抑制率50%为阳性标准，重复检测2次。

参考以上4种农药酶抑制率法最低检测限和蔬菜上最低限量(表3)，分别设置一定浓度梯度，以缓冲液为介质，进行酶抑制率检测。对易产生假阳性的蔬菜，如韭菜、生姜，对滤液于80 ℃加热10、20 min，测定其酶抑制率。滤液加热后会出现浑浊和絮状物，应过滤后进行检测。

2 结果与分析

2.1有机磷和氨基甲酸酯类农药残留情况从表1、2可知，本地种植的蔬菜农药超标率较低，超市的春季和冬季的蔬菜主要来自于南方，农药残留量比较大。主要残留超标农药为毒死蜱，未检出其他3种农药。

表1 胜利农场区域内温室、大棚、露地蔬菜农药残留检出情况

表2 胜利农场超市蔬菜农药残留检出情况

注：韭菜和生姜的平均抑制率均为加热后测得的。

对易产生假阳性的韭菜和生姜，在每次抽样检测的同时，进行80 ℃加热处理的检测。具体结果见图1。

从图1可以看出，韭菜滤液经加热处理后抑制率均有下降，加热10和20 min抑制率差别很大，处理韭菜假阳性以80 ℃加热20 min为宜。韭菜样品4经加热20 min抑制率几乎无变化，经过气相色谱验证，检出毒死蜱农药残留超标，含量为0.58 mg/kg。韭菜中毒死蜱国家最低限量值为0.1 mg/kg，超标近6倍。而韭菜样品5和样品6加热后抑制率仍近40%，色谱检测同样是毒死蜱超标。结果表明：以抑制率50%为阳性标准易产生假阳性，应以小于35%为合格蔬菜，以抑制率35%～50%为可疑农药超标蔬菜，大于50%为农药超标蔬菜，后2种情况需用色谱法定性定量检测。而其他假阳性蔬菜，80 ℃加热20 min后消除了假阳性，抑制率小于35%，色谱法也未检测出农药残留，可见酶抑制率法和色谱法的结果基本一致。

图1 易产生假阳性蔬菜80 ℃处理的抑制率情况

2.2不同浓度的农药抑制率情况由图2可知，若以抑制率20%为检测限，结果表明氧化乐果含量为3 mg/kg，毒死蜱含量为0.030 mg/kg、敌百虫含量为0.001 mg/kg，呋喃丹含量为0.001 mg/kg时检出。该方法对敌百虫和呋喃丹灵敏度高，较气相色谱法检出限还低约1个数量级，毒死蜱检出限和气相色谱基本一致，而氧化乐果灵敏度差，远远高于气相色谱检出限和国家限量值。

3 结论

利用酶抑制率法对胜利农场前期蔬菜进行抽样检测，春季本地大棚、温室和露地的蔬菜农药残留不超标，农药残留超标的蔬菜主要为夏季本地的小白菜和秋冬季外运南方的韭菜，蔬菜样品超标率为3.9%，高毒和禁用的农药没有检出，作为高毒农药的替代品，毒死蜱残留问题严重。本研究采用酶抑制法检测四种有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留方法快速有效，对敌百虫和呋喃丹的灵敏度比气相色谱法检出限还低约1个数量级，毒死蜱的检出限也能达到气相色谱的标准，而对氧化乐果的农药残留检测灵敏度差，最低检出浓度远远高于气相色谱检出限和国家限量值，不适宜用该方法来检测其残留。