不同破壁法对金银花中挥发油和绿原酸得率的影响

冯华郑佳柳宁

（岳阳职业技术学院 生物医药系， 湖南 岳阳 414000）

不同破壁法对金银花中挥发油和绿原酸得率的影响

冯华郑佳柳宁

（岳阳职业技术学院 生物医药系， 湖南 岳阳 414000）

目的 探讨不同的破壁方法对金银花中挥发油和绿原酸提取的影响。方法 采取温差破壁技术、酶法破壁、低温超音速气流破壁技术和低温高频振动破壁技术，以破壁率、挥发油和绿原酸的得率作为评价指标，筛选最佳破壁方法;比较最佳破壁方法提取挥发油和绿原酸与传统不破壁水提技术的提取效果。结果 经过低温高频振动破壁后金银花的破壁率以及挥发油和绿原酸的得率最高；且与传统不破壁水提相比，挥发油得率提高了3倍，绿原酸提高将近1倍。结论 植物破壁技术的应用，极大的提高了金银花资源的利用率，所得产品质量好。

金银花；破壁；挥发油；绿原酸

金银花（Lonicera japonica Thunb.），忍冬科多年生常绿缠绕灌木，气芬郁而味甘，是我国常用中药材、特有的天然产品和战略性生物化工资源[1]。金银花加工业是我国具有资源优势的特色生物产业，我国金银花产量占世界总产量95%[2]。金银花芳香油和绿原酸是从金银花中提取分离得到的，是在健康相关产品（食品、药品、化妆品、日用品）中应用十分广泛的两种生物活性成分[3]。

金银花有效成分的分离提取兴起于20世纪90年代，一般采用传统水煮提取工艺或乙醇多次提取后再经过各种除杂技术，其提取分离技术时间长、有效成分提取不充分且易被破坏、消耗大量的原料和能量、污染环境。近年来，植物破壁技术发展迅速，破壁后有效成分能够直接溶出而提高了提取率[4]。植物破壁技术正逐渐从实验室研究向规模化生产应用转化。目前，技术成熟且已在规模生产中广泛应用的植物破壁技术主要有温差破壁技术、酶法破壁、低温超音速气流破壁技术和低温高频振动破壁技术[5]。本研究以金银花为原料，采用不同破壁方式处理，通过分析优化出最佳的金银花破壁方法，为金银花资源深度利用和开发提供了理论依据。

1 试剂与仪器

金银花（湖南如虹制药有限公司提供，经鉴定为忍冬科植物忍冬的初开的花），纤维素酶，果胶酶，木聚糖酶，无水乙醇，乙酸乙酯。

高效液相色谱仪CK-50（上海美资达科技有限公司），气相色谱仪LCHG-08（河南信阳计量仪器公司），高频振动破壁粉碎机SW-60B(大连机械设备集团)，超音速气流粉碎机WQL（常州海涵干燥设备科技有限公司），超声波仪TLMNZ09（南京中旭电子科技有限公司），高速离心机S7-21(上海精科制造有限公司)，显微镜CX40型（日本奥林巴斯光学工业公司）。

2 方法

2.1 破壁超声波提取金银花中有效成分的工艺流程

2.1.1 金银花鲜花经各种方法破壁。

2.1.2 加5倍量水，在300W超声波作用下，常温浸提50min。

2.1.3 冷藏静置24h。

2.1.4 浸提液高速离心（3000r/min以上），分离油水混合液。得到金银花粗油和金银花水提液。

2.1.5 金银花粗油进行分子蒸馏，得到金银花精油；金银花水提液，加HCL调pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脱色，过滤，滤液浓缩干燥得到淡黄色绿原酸。

2.2 金银花破壁实验方法

2.2.1 温差破壁法 将金银花放入研钵，研碎后将其置于-l0℃的冰箱内存放24h后，迅速加入80%的热水(比例为5g：1mL），大致可使金银花浸湿搅拌，然后迅速冷却至40～45℃，并在恒温45℃连续搅拌6h。

2.2.2 酶法破壁 将金银花研磨后加水，配成20%的金银花溶液。再添加纤维素酶和果胶酶各0.2%(质量分数)。反应温度维持在40～45℃，间歇搅拌5h。然后在反应液中添加0.2%(质量分数)的蛋白酶，继续搅拌5h，加热使酶失活，可得破壁金银花混合液。

2.2.3 低温超音速气流破壁 超音速气流粉碎机开机预冷至-20℃，然后将金银花破壁粉碎至5～50μm，待用。

2.2.4 低温高频振动破壁 高频振动破壁粉碎机开机预冷至-20℃，然后将金银花破壁粉碎至5～50μm，待用。

2.3 用血球计数板计算各种破壁方法的破壁率

显微镜下破壁率的计算：取0.50g破壁金银花样品，用纯水稀释，定容至25.00mL，混匀，制薄片，各重复片3张。生物显微镜下随机观察100个视野，计算已破壁和未破壁的细胞数，其中已破壁的细胞数占观察的总细胞数的百分数即为花粉的破壁率[6]。

计算公式：破壁率/%=已破壁金银花粒数／观察金银花细胞总粒数×100%

2.4 挥发油和绿原酸的含量测定

挥发油的含量测定采用金银花挥发油称重法，绿原酸的含量测定采用HPLC（CHP2010版附录ⅥD）进行测定。

3 结果及分析

3.1 金银花破壁前后细胞形态比较

金银花破壁前后细胞形态比较见图1。

图1 金银花破壁前后细胞图

3.2 挥发油含量测定

金银花粗油经分子蒸馏后称重，然后计算挥发油的得率。并且本研究对金银花中的挥发油进行初步的气相色谱确定，经分析鉴定中健欣元生物科技有限公司栽培的金银花挥发油主要成分为：芳樟醇、a一萜品醇、环氧芳樟醇、顺芷酸一3一已烯酯、顺一3一已烯醇、对甲氧基苯甲醛、顺一菜莉酮等成分[7]。检测结果见图2。

图2 金银花挥发油气相图谱

3.3 绿原酸含量测定

色谱条件色谱柱为国产KromasilC18柱（250mm×4.6mm，7μm）；柱温25℃；流动相为乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速为1mL·min-1；检测波长327nm。其检测结果见图3。

图3 破壁金银花的色谱图

3.4 不同破壁方法结果比较

不同的破壁方法（不破壁、温差破壁、酶法破壁、低温超音速气流破壁、低温高频振动破壁）对金银花的破壁率以及金银花的挥发油和绿原酸的得率的影响。其结果见表1。

表1 不同破壁方法结果比较

由表1可以看出，低温高频振动破壁法的破壁率最高，高达85.4%。总趋势上说破壁率越高，金银花中有效物质溶出量越高。但是温差破壁法由于有加热这一过程造成挥发油的得率大大降低。低温超音速气流破壁技术难以粉碎纤维性、韧性中药材，适合含水量不高于4%的十分干燥的物料进行破壁粉碎，而且在粉碎作用时存在相对高速气流，可将药物的挥发性成分带走，造成药效损失。低温高频振动破壁粉碎技术是利用球形或棒形磨介作高频振动而产生的冲击、摩擦、剪切等作用力来实现对物料的破壁粉碎。振动磨用弹簧支撑磨机体，由一带有偏心块的主轴使其振动，磨机通常是圆柱形或槽形，振动磨的效率比普通磨高10-20倍，其粉磨速度比常规球磨机快得多，而且能耗低数倍，细胞破壁提取实际是一个生物活性成分在破壁后的直接溶出过程，因而，提取条件温和、溶媒少、提取速度快、资源利用率高、提取成品质量好。

表2 传统不破壁水提技术和破壁超声提取技术比较

3.5 破壁超声波提取与传统不破壁水提技术提取两种方法的比较结果

在正交试验确定的破壁后超声浸提最佳工艺的条件下[8]，提取和分离挥发油和绿原酸，相比传统不破壁水提工艺，挥发油得率为0.481%，比传统煎煮法提高了3倍，绿原酸得率为5.31%，比较结果见表2。比传统煎煮法提高将近1倍。同时耗时耗能均有所降低。

4 结论

通过采用不同破壁方法的同时制备金银花中挥发油和绿原酸，得出经低温高频振动破壁后的金银花破壁率最高，挥发油和绿原酸得率也最高。在正交实验确定的最佳工艺参数下提取挥发油和绿原酸，挥发油得率为0.481%，比传统不破壁水提技术提高了3倍，绿原酸得率为5.31%，比传统不破壁水提技术提高将近1倍。金银花经低温高频振动破壁后再同时提取挥发油和绿原酸，具有以下优点：

4.1 工艺更科学、合理

金银花中绿原酸的提取现有技术多采用乙醇多次提取后再经过各种除杂技术提纯绿原酸；金银花精油的制备多采用水蒸气蒸馏后有机溶剂再萃取，精油得率低。金银花中含有许多热敏性的物质，在高温蒸馏或煎煮的作用下会被破坏，而且多数不挥发的功能物质留在母液中被丢弃，造成金银花固有成分缺失，药用成分破坏较严重[9]。金银花采用破壁和超声浸提，提取条件温和，纯化工艺更合理，极大限度提取其中有效成分的同时，有效保护了其中生物活性成分。

4.2 资源利用充分

金银花作为一种中药，其组成十分复杂，主要以绿原酸、木樨苷、黄酮类物质为代表。《中国药典》以金银花中的绿原酸作为金银花的表征物质，是金银花的主要功效物质[10]；金银花的花香气味主要来源于其低沸点的挥发性组分，通过分子蒸馏可获得高纯度的芳香精油。本发明最大限度利用了资源，从中药资源保护角度上具有重要的意义。

4.3 低能耗、环保节能

传统提取工艺需要高温高压、大量溶媒、反复提取，生产工艺能源消耗大、污染环境。而本工艺只采用低温高频振动粉碎破壁技术超声水提，溶媒少、提取速度快、耗能少，无有害溶剂、节约能源、保护了环境

4.4 质量优势

金银花采用先进的破壁超声提取得到的绿原酸和精油2种产品，极大限度地提高了金银花中有效成分的利用率，利用先进的HPLC方法对其有效成分进行检测，绿原酸的得率达95%以上；精油为浅黄色液体，主要化学成分如芳樟醇、萜品醇、环氧芳樟醇、香叶醇各种指标都达到了文献标准。从而保证了产品的质量和疗效。

本研究组采用植物破壁技术，配超声波提取、超滤、萃取、分子蒸馏等手段，同时制备出具有高附加值金银花有效成分产品绿原酸和挥发油，极大的提高金银花资源的利用率，提取效率高，所得产品品质好。

[1]贾文杰.金银花研究进展[J].吉林农业，2012(8)：223-224

[2]张守平，辛宁，王柳萍.金银花化学成分及质量控制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2007，14(3)：84-86.

[3]陈晓麟.金银花研究概况[J].重庆教育学院学报，2007，20 （6）：15-18.

[4]唐维，张星海．花粉破壁方法的研究进展[J]．食品与发酵工业，2003，29(2)：86-92．

[5]包秀萍，郭丽梅，刘敏，等.花粉破壁方法的研究[J].杭州化工，2009，39(4)：26-28．

[6]杨义雄，王宫.多酶体破壁提取蜂花粉中活性蛋白的工艺研究[J].福建中医学院学报，2009，19(3)：24-26.

[7]张军，赵光莉，庄桂东，等.SFE-MD技术分离提纯金银花挥发油及其成分分析[J].精细化工，2008，25（1）：49-53.

[8]张晓东，潘国凤，吕圭源.超声提取在中药化学成分提取中的应用研究进展[J].时珍国医国药，2004，15(12)：861-862．

[9]杨金平，严军，曲永胜，等.金银花产销趋势分析[J].中国现代中药，2003，15(8)：704-706.

[10]刘钢，张平，夏泉.正交试验法优选金银花的提取工艺研究[J].海峡药学，2012，24(8)：17-19.

（责任编校：马余平）

Effects of Wall-broken Methods on Yield of Volatile Oil and Chlorogenic Acid of Lonicera Japonica Thunb

FENG Hua ZHENG Jia LIU Ning

(Biological Medicine Department,Yueyang Vocational and Technical College,Yueyang，Hunan 414000)

Objective：To investigate the effects of Wall-broken methods on Yield of volatile oil and chlorogenic acid of Lonicera Japonica Thunb.Method：Screening of the best extraction method being based on temperature difference between the wall technology,breaking by enzyme,low temperature supersonic airflow wall technology and low frequency vibration broken technology,and using the broken rate and the yield of the volatile oil and chlorogenic acid as index to compare the effect of extraction of the Wall-breaking methods and the Wall-unbroken water extraction technology.Result：The method to get the highest broken rate and the yield of the volatile oil and chlorogenic acid is using the technology of low frequency vibration wall-broken. compared with Wall-unbroken water extraction technology,the yield of the volatile oil increase 3 times and chlorogenic acid increase nearly1 time.Conclusion:The technology of Wall-broken greatly improve the utilization rate of resources of Lonicera japonica Thunb.

Lonicera Japonica Thunb;Wall-broken;volatile oil;chlorogenic acid

R 282.710.2

A

1672－738X（2014）01－0077－05

2013-10-31

岳阳职业技术学院2011年重点项目（YZ1101M）。

冯华（1983—），女，湖南岳阳人，药学讲师，生物化学与分子生物学硕士。主要研究方向：中药新药开发研究。