EAE发病机制中MALT1、IL-17作用的探讨*

王贵泉张宇张美妮②

EAE发病机制中MALT1、IL-17作用的探讨*

王贵泉①张宇①张美妮①②

目的：通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型，观察小鼠脑组织中黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1与血清白介素-17（Interleukin-17）的表达情况，并探讨两者在EAE发病机制中的作用。进一步探究MALTI是否可以作为多发性硬化（MS）的治疗靶点，以便寻找治疗MS的新手段。方法：将36只C57BL/6雌性小鼠按照随机数字表法分为EAE组和佐剂组各18只，EAE组采用MOG与完全弗氏佐剂的沫状混合物制备EAE模型，佐剂组仅给予弗氏佐剂。观察每只实验动物发病情况并每隔2 d进行一次神经功能评分。分别于免疫后14 d、24 d、40 d两组小鼠随机各取6只，心脏取血并4%多聚甲醛灌注取脑组织。取小鼠脑组织石蜡切片，免疫组化方法检测各组小鼠脑组织中MALT1并用ELISA法检测血清IL-17表达。结果：EAE组与佐剂组的小鼠神经功能评分、体重、血清中IL-17含量和脑组织中MALT1蛋白阳性细胞数比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。EAE组中24 d组小鼠的神经功能评分（2.50±0.55）分明显高于14 d组的（0.83±0.41）分和40 d组的（1.50±0.32）分，体重（17.04±0.41）g明显少于14 d组的（18.33±0.49）g和40 d组的（18.15±0.13）g，且血清中IL-17含量（288.00±26.45）pg/mL明显高于14 d组的（122.60±10.11）pg/mL 和40 d组的（184.40±29.51）pg/mL，脑组织中MALT1蛋白阳性细胞数（183.80±9.25）个明显多于14 d组的（78.25±9.47）个和40 d组的（133.50±19.87）个，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：EAE小鼠神经功能评分越高，血清中IL-17含量越高，MALT1表达也越多，提示MALT1参与了EAE小鼠的发病过程，其机制可能与MALT1在EAE小鼠上调血清IL-17表达有关。

实验性自身免疫性脑脊髓炎； 多发性硬化； 黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1； 白介素17

多发性硬化是一种中枢神经系统白质的炎性脱髓鞘疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是人类中枢神经系统常见的脱髓鞘疾病即多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的动物模型[1-2]。但其发病机制尚不清楚。在对EAE模型的研究中发现，自身反应性脑炎性Th1和Th17 CD4+T细胞通过免疫活化并入侵中枢神经系统，促进单核细胞与中性粒细胞等免疫效应细胞聚集并引起与人类多发性硬化（MS）临床症状、组织病理变化相类似的脱髓鞘等自身免疫性炎症[3-4]。IL-17 是Th17细胞分泌的致炎性细胞因子，具有强烈的致炎作用，引起中枢神经系统脱髓鞘病变[5]。有学者认为，核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）活化后进入细胞核调节炎症因子表达而引起脱髓鞘病变[6]。黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1（Mucosa associated lymphoid tissue lymphoma transport protein 1，MALT1）被认为是NF-κB通路的激活物，利用敲除MALT1基因的小鼠诱导EAE，即使有淋巴细胞浸润，也无EAE的任何症状[7-8]。目前国内关于EAE的研究主要集于IL-17尚无MALT1在EAE发病机制中作用的相关报道，本实验旨在探讨MALT1及IL-17在EAE小鼠发病机制中作用的探讨。

1 材料与方法

1.1 实验分组 将18～20 g，8～10周，C57BL/6雌性小鼠（北京维通利华实验动技术有限公司）36只按照随机数字表法分为EAE组和佐剂组各18只。两组小鼠一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）具有可比性。

1.2 EAE模型制备 用0.01 mol/L的PBS将MOG35-55（武汉博士德公司）稀释。然后将稀释液与等量含结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂（武汉博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水状，制成诱导EAE的抗原乳剂。EAE组小鼠背部中央偏头侧皮下点注射抗原乳剂。利用生理盐水代替MOG35-55稀释液参照上述方法制备乳剂，供对照组使用。各组于免疫后第0天、第2天分别进行腹腔注射百日咳毒素（美国Sigma公司）600 ng/只作为免疫增强剂。

1.3 数据采集 小鼠经MOG免疫后第8天开始，隔日采用盲法由两名观察者称量并记录每只小鼠的体重，采用国际通用的5分评分制对小鼠进行神经功能评分。评分标准：0分，无任何症状；1分，尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分，一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复；3分，双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分，双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以±0.5计。

1.4 小鼠组织提取 分别于免疫后14、24、40 d，于EAE组与佐剂组中随机抓取各6只小鼠（即14 d组、24 d组、40 d组），用10%水合氯醛0.1 mL/20 mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血并编号，左心室灌注磷酸盐缓冲液至肝脏变白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大脑并编号。

1.5 ELISA法检测血清IL-17 小鼠血液离心后取血清零下70 ℃保存，IL-17的浓度采用上海西唐生物科技有限公司的ELISA试剂盒，具体方法参照试剂盒说明书。参照各因子的标准曲线计算其含量，结果以pg/mL表示。

1.6 免疫组化 小鼠脑组织提取后于4%多聚甲醛中浸泡过夜，并脱水，石蜡包块，MALT1抗体（1抗、2抗）购自武汉博士德公司。参照试剂盒说明书操作，并在相关技术指导老师指导下进行。

1.7 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，多组间参数比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠临床症状评分与体重变化 EAE组小鼠8 d 到10 d陆续开始发病，发病时表现为皮毛不光滑、食欲下降、体重减轻、活动量减少；同时相继出现中枢神经系统受损症状，首先是表现为尾部肌张力低下，身体向一侧倾倒，进一步进展为双侧后肢无力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，无因病情危重而死亡。佐剂组小鼠一直没出现神经系统症状，体重持续上升，与EAE小鼠相比，神经功能评分差异显著。如图1所示，EAE组中14 d组小鼠神经功能评分（0.83±0.41）分，24 d组小鼠神经功能评分（2.50±0.55）分，40 d组小鼠神经功能评分（1.50±0.32）分，其中两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。EAE组与佐剂组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。如图2所示，EAE组中14 d组小鼠体重为（18.33±0.49）g，24 d组小鼠体重为（17.04±0.41）g，40 d组小鼠体重为（18.15±0.13）g，其中14 d组与24 d组比较，24 d组与40 d组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），14 d组与40 d组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。佐剂组中两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05），EAE组与佐剂组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 14 d、24 d、40 d小鼠神经功能评分

图2 14 d、24 d、40 d小鼠体重变化

2.2 IL-17检测结果 IL-17在血清中的ELISA检测，用ELISA方法检测血清中IL-17 OD值，用软件换算OD值与IL-17的浓度。EAE组中24 d组的小鼠血清中的IL-17浓度明显高于14 d组和40 d组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。佐剂组中24 d组小鼠血清中的IL-17含量与14 d组和40 d组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而EAE组各小组与佐剂组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。结果表明，神经功能评分较高时IL-17含量也较高。

表1 两组血清IL-17含量的比较（±s） pg/mL

表1 两组血清IL-17含量的比较（±s） pg/mL

组别 14 d组 24 d组 40 d组EAE组（n=18） 122.60±10.11 288.00±26.45 184.40±29.51佐剂组（n=18） 36.24±7.113 53.57±31.65 40.57±10.51

2.3 MALT1免疫组化结果 采用免疫组化法（SV002 兔-IgG-两步法）检测MALTI蛋白表达，其具体的步骤按照试剂盒说明书进行。每组选取染色清晰石蜡切片，光镜下（40×）随机选取3个视野，并在高倍镜下（400×）观察星形胶质细胞胞浆可见免疫阳性细胞，并计数。结果显示，EAE组中24 d组的阳性细胞数明显多于14 d组和40 d组，且EAE组中40 d组的阳性细胞数明显多于14 d组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而佐剂组中14 d组、24 d组和40 d组的阳性细胞数两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），而EAE组各小组与佐剂组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠脑组织星形胶质细胞中MALT1蛋白阳性细胞数的比较（±s） 个

表2 两组小鼠脑组织星形胶质细胞中MALT1蛋白阳性细胞数的比较（±s） 个

组别 14 d组 24 d组 40 d组EAE组（n=18） 78.25±9.47 183.80±9.25 133.50±19.87佐剂组（n=18） 35.25±8.02 32.75±6.50 41.25±10.53

3 讨论

MALT1作为NF-κB通路的一个激活成分，神经系统内NF-κB主要存在于神经元、血管内皮细胞及胶质细胞，NF-κB是调控炎性反应的重要信号系统，在EAE免疫调节及炎性反应发展中有重要意义[7，9]。该信号系统能调控多种黏附分子、生长因子、细胞因子以及急性期蛋白的表达，并在炎性反应和免疫诱导、细胞增殖和分化等EAE多种病理过程中发挥重要作用。此外NF-κB可促进黏附分子表达，介导外周炎性细胞进入脑组织[10]。MALT1基因剔除法表明，MALT1的支架功能在T细胞抗原受体（TCR）信号刺激的下游NF-κB活化中是必不可少的[11]。其蛋白酶活性对成熟的NF-κB反应也是相当重要的，该反应决定了T细胞活化的程度[12]。

有研究发现，炎性细胞Th17被认为是诱导EAE的主要反应细胞，而Th17细胞产生致炎性细胞因子IL-17，其具有强烈的致炎作用，从而引起中枢神经系统脱髓鞘病变[5]。本实验结果显示，MALT1阳性细胞数较多时，该小鼠血清中IL-17的含量也较高，同时其肢体功能障碍也较严重，这些结果提示MALT1可以促使IL-17的分泌。本结果可能与MALT1激活NF-κB通路，导致Th0细胞向Th17细胞分化有关。本实验结果与有些学者研究的MALT1影响Th17细胞的致炎性作用相似。

综上所述，MALT1在EAE小鼠发病中有极其重要的作用，其机制可能是由于MALT1是NF-κB通路激活过程中一个重要的中心环节，并通过激活NF-κB而上调IL-17在血清中的含量，进而引起自身免疫性脱髓鞘病变。进一步研究如何抑制MALT1的表达或者抑制其激活NF-κB通路，可以为今后探索MS的治疗靶点提供新思路。

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Investigation the Role of MALT1 and IL-17 in the Pathogenesis of EAE

/WANG Gui-quan，ZHANG Yu，ZHANG Mei-ni.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：013-016

Objective：To observe the expression of Interleukin-17 in serum and MALT1 in brain tissue of mice through the establishment of experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE） model in mice，and to explore their roles in the pathogenesis of EAE.To further explore whether MALTI can be used in multiple sclerosis（MS） therapeutic target in order to find new ways for the treatment of MS.Method：36 C57BL/6 female mice were randomly divided into the EAE model group and the adjuvant group，18 rats in each group.The EAE model group was made the EAE model using MOG and foam-like mixture of complete Freund’s adjuvant，the adjuvant group was only given Freund’s adjuvant. Each experimental animal infection situation was observed，and every two days for a neurological function score.Six mice were selected from two groups randomly after immunization 14 days，24 days，40 days，got heart blood，poured into 4% paraformaldehyde and removed the brain tissue.Took paraffin sections of brain tissue from mice，detected MALT1 in the mouse brain tissue by immunohistochemical method and IL-17 expression in serum by ELISA.Result：There were statistically significant differences in the nerve function score of mice，weight，the content of IL-17 in serum and MALT1 protein positive cells in the brain between the EAE model group and the adjuvant group（P＜0.05）.The neurological function score of 24 d group in EAE model group was （2.50±0.55）score，it was significantly higher than the （0.83±0.41）score in 14 d group and （1.50±0.32）score in 40 d group，the weight of 24 d group in EAE model group was（17.04±0.41）g，it was significantly less than （18.33±0.49）g in 14 d group and （18.15±0.13）g in 40 d group，the content of IL-17 in serum of 24 d group in EAE model group was （288.00±26.45）pg/mL，it was significantly higher than （122.60±10.11）pg/mL in 14 d group and （184.40±29.51）pg/mL in 40 d group，and MALT1 protein positive cells in the brain of 24 d group in EAE model group was （183.80±9.25），it was significantly more than （78.25±9.47） in 14 d group and （133.50±19.87）in 40 d group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：EAE mouse neural function score higher，the higher the content of serum IL-17，the higher the MALT1 expression.It shows that MALT1 is involved in thepathogenesis of EAE mice，and the pathogenic effect of MALT1 may be associated with the increased expression of IL-17.

Experimental allergic encephalomyelitis； Multiple Sclerosis； Mucosa associated lymphoid tissue lymphoma transport protein 1； Interleukin-17

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.005

2014-03-14） （本文编辑：欧丽）

山西省自然科学基金（2013011052-3）

①山西医科大学第一临床医学院 山西 太原 030001

②山西医科大学第一医院

张美妮

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新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目资助项目（2012211A066）

①新疆医科大学第一附属医院 新疆 乌鲁木齐 830054

通信作者：丁岩

First-author’s address：The First Clinical Medical College of Shanxi Medical Unirersity，Taiyuan 030001，China