酶免疫测定法检测粪便孕酮进行母猪早期妊娠诊断的研究

冯建刚，魏全伟，李 岩，石放雄

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

养猪业是我国畜牧业中的支柱产业，在生猪养殖业中，繁殖效率是决定母猪养殖经济效益的关键因素之一。母猪繁殖率的高低取决于发情鉴定、配种授精、妊娠检查及接产等多种技术。

母猪的早期妊娠诊断是提高母猪繁殖效率和畜牧业生产效益的重要技术措施，尤其是配种后20d前后的早期妊娠诊断是母猪繁殖技术中十分重要的内容。对母猪而言，每耽误5.5个发情周期就少产1窝。因此，母猪配种后20d前后的早期妊娠诊断尤为重要。

动物体液中孕激素的含量变化主要是由于卵巢黄体发育和退化的结果，发情期孕酮水平最低，黄体期孕酮水平较高，妊娠期孕酮水平则一直维持在较高水平[1-2]。类固醇激素可在动物血液中迅速被结合，通过不同的途径分泌到尿液和经胆汁排到肠道中，通过与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，形成水溶性的无活性的葡萄糖苷酸或硫酸盐而被排泄到粪便和尿液中[3]。因此，测定粪便等样品中孕酮含量能进行卵巢机能监控。目前用于监测孕酮含量的方法主要有以下几种：放射免疫测定法，使用放射性物质标记，具有很高的检测灵敏度及稳定性，但仪器设备昂贵，且有放射性污染；酶免疫测定法，使用酶标记，灵敏度仅次于放射免疫测定法，仪器设备相对便宜；乳胶凝集试验测定法，用了特化的乳胶珠，灵敏度和重复性均不如前两种方法。目前虽有使用兽用B型超声波诊断的，一般也需在输精后35d以上才能进行。

在国内母猪养殖中，监测粪样孕酮含量以提高母猪繁殖效率的技术，还未能在基层养殖场及养殖农户推广应用。本文建立了简便实用的母猪粪样孕酮含量的酶免疫测定法，并用于母猪早期妊娠诊断。

1 材料与方法

1.1 试验药品及试剂

孕酮多克隆抗体、酶标抗原与ELISA试剂盒均由南京农业大学动物繁殖研究室自行制备[4]，常规试剂均为分析纯购于国药集团。

1.2 试验仪器

酶标仪为美国Bio-TEK产品、型号为ELX800；振荡器、精密电子天平、加样器、烘箱、96孔酶标板（购于Geriner公司），WED-2000AV型兽用掌上B型超声诊断仪等常规仪器。

1.3 粪样采集及测定

1.3.1 粪样采集

母猪来源于灌云县畜旺生猪养殖场,所有母猪均在相同条件下进行饲养管理，采集配种后21～25d母猪（共164头）的粪便作为检测对象。

1.3.2 粪样处理

收集母猪粪便并称0.5g溶于20mL蒸馏水中，离心（3000r/min，10min），取上清液，置于4℃冰箱待测。

1.3.3 样品测定

包括如下8项程序：

①包被抗体:用包被缓冲稀释液将孕酮抗血清稀释成包被工作液，在已编号的载体板各孔内(第12列E、F、G、H排的4孔除外)加抗血清稀释液200µL加盖4℃冰箱中静置24～48h；

②封闭：舍去内容物，封闭液封闭包被孔，每孔280µL，37℃放置2h；

③洗涤：取出反应板甩掉封闭液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；

④加样：在包被板A排第1～12列和F排第1～11列各孔内依次加稀释后的待测样本100µL，B和C排重复A排加样,G和H排重复F排加样，D和E排按照浓度低至高的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次；

⑤加酶标物：加样后将板置于4℃冰箱中，配制酶标物，取出载体板，在各孔内加酶标物100µL,置37℃培养箱中反应2h；

⑥洗涤：取出反应板，甩掉反应液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；

⑦加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200µL，室温避光反应0.5h，此时反应液呈橙黄色；

⑧加终止液：各孔加终止液50µL，此时反应液呈棕黄色；读取OD492nm值，将OD492nm值换算为孕酮浓度。

1.3.4 母猪早期妊娠诊断

配种后母猪粪样中孕酮的含量超过150ng/g时，就可确认其妊娠；小于150ng/g时，可初步确认其空怀。

1.4 标准曲线的制作[4]

选择合适的抗体浓度包被、合适的酶标抗原工作浓度，制作标准曲线。标准曲线以系列稀释浓度的孕酮标准液建立测定梯度,并以各浓度(包括0ng/ mL)的OD492nm值转换成E/E0值，其中无孕酮标准时的OD492nm值为E0，各相应浓度的孕酮标准时的OD492nm值为E，E/E0×100%=Alnx+B(x为样本中孕酮浓度)。因为E/E0值与lnx成线性回归关系,从而可以计算回归曲线的方程和相关系数。

1.5 兽用B超诊断母猪早期妊娠

1.5.1 操作方法

在限饲栏内，母猪侧卧、趴卧或站立姿势均可以操作，不需保定。用湿毛巾擦净腹部污物。母猪侧卧与趴卧时在探查部位涂布耦合剂，而站立时则在探头上涂布耦合剂。将探头与体轴平行，靠近股内侧或倒数第2～3对乳头，查到膀胱后，向膀胱上部或侧面扫查。妊娠早期，探头朝向耻骨前缘，骨盆腔入口方向，或以45°角斜向对侧上方，探头紧贴皮肤一点，进行前后和上下的定点扇形扫查。随妊娠日龄的增加，探查部位逐渐前移，最后可达肋骨后端。

1.5.2 结果判定

如显示孕囊或胚胎的断层像诊断为怀孕；显示两侧未孕子宫的断层像为空怀。

1.6 数据处理

数据采用Execl软件和x2检验进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 测定粪样P4酶免法的建立

将定量的P4标准进行梯度稀释,建立的典型标准曲线如图1。

在一般操作情况下,结合率(E/ E0)与孕酮浓度的自然对数lnx之间的典型直线回归方程式为:E/E0=-10.7 1lnx+62.751(r=-0.9947)。

2.2 方法学鉴定[4]

对建立的方法进行方法学鉴定，结果如下：灵敏度8ng/g,回收率为95.78%；重复性，重复测定高、中、低水平样本中的孕酮含量,板内和板间变异系数分别为6.8%(n=9)和11.23%(n=8)，稳定性好；特异性，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01%，与睾酮交叉反应率为0.35%。

2.3 兽用B超诊断母猪早期妊娠

2.3.1 空怀的声像图特征

空怀母猪膀胱前方的子宫区域显示回声均匀的子宫角影像，对超声的反射弱，呈各种不规则的圆形弱反射区，子宫内检测不到孕囊或孕体，如图2所示。

2.3.2 妊娠的声像图特征

在配种35d后，妊娠母猪子宫内能非常清楚地看到孕囊，大小随着妊娠期的延长而增大，甚至能发现胎体，直径6～10cm。胎儿骨骼反射增强，出现一闪一闪的胎动，增强的骨骼出现声影，如图3所示。

图1 孕酮标准曲线

图2 空怀母猪B超声像图

图3 35 d妊娠诊断的声像图

2.4 母猪早期妊娠诊断的结果

对灌云县畜旺猪场的164头初产母猪进行了粪便孕酮含量的测定，用母猪粪便孕酮酶免疫法测定配种后21～25d母猪粪样中孕酮浓度，测定结果分布如图2所示。配种后母猪粪样中孕酮的含量超过150ng/g时，确认其妊娠；小于150ng/g时，确认其空怀。由所测结果得知，除了配种后21、24d时各检测出1头，25d时检测出4头为空怀（合计6头）外，其他的均为妊娠，与后来的诊断结果完全一致。

通过母猪粪便孕酮酶免疫法检测配种后21～25d粪样孕酮浓度进行早期妊娠诊断和兽用B超对配种35d后妊娠诊断的准确率如表1所示，基于粪样孕酮水平的妊娠诊断标准，配种后21d的准确率为96.1%，22d的为100%，23d的为100%，24d的为96.3%，25d的为84%，妊娠诊断准确率95.9%(140/142)；空怀诊断的准确率为72%(13/18)；兽用B超对配种35d后母猪妊娠诊断的准确率为97.3%。如果连续2d进行妊娠诊断，其诊断准确率有显著的提高。

图4 配种后21～25 d母猪粪样孕酮浓度（实心黑点为妊娠，空心点为空怀）

3 讨论与结论

已有很多文献报道通过检测血液中的孕酮并根据孕酮水平变化信息来进行母猪的发情鉴定、妊娠鉴别及卵巢疾病诊断，但采集血液会对动物产生一定的应激并且烦琐[6]。本文用母猪粪便孕酮酶免疫法以粪样为检测样品，对母猪做早期的妊娠诊断。研究结果表明，母猪粪样孕酮酶免疫法是一种实用、安全可靠和高效的早期妊娠诊断方法。

Hultén等人监测了在同一个发情周期中母猪粪便和血液中孕酮浓度的变化，结果表明，除了粪样中孕酮的变化比血液中约推迟了2d外，粪便中孕酮浓度的变化与血液孕酮浓度的变化趋势基本相似。有报道在同一个发情周期中粪样雌激素的变化也比血液中的变化推迟2d左右[7]。进一步说明血液中的类固醇激素经由肝脏代谢，以葡萄糖苷酸或硫酸盐通过消化道最终粪便的方式排出体外，此过程约需要2d的时间。在临床应用中，测量粪便中类固醇激素浓度时必须考虑这一点。配种后血液中孕酮浓度约19～23d达到很高水平，因此，本实验通过粪样孕酮酶免疫法进行早期妊娠诊断，需要检测配种后第21～25天的粪样孕酮浓度。以粪样中孕激素浓度150ng/g为妊娠诊断的临界点，是根据母猪妊娠或空怀测定粪样孕激素浓度的平均数加减2个标准差为基准而确定的，该结果与Masaharu等(2010)的研究结果基本相似。通过母猪粪便孕酮酶免疫法对母猪进行的早孕诊断的准确率为95.9%；空怀诊断的准确率为72%；如果连续2d进行诊断，其诊断准确率有显著的提高。兽用B超对配种35d后母猪妊娠诊断的准确率为97.3%。虽然兽用B超妊娠诊断的准确率较粪便孕酮酶免疫法高，但一般也需在输精后35d以上才能进行，而使用酶免疫激素测定技术就可在输精后1个情期（21～25d）进行准确的妊娠诊断。因此，应用此方法能尽早作出妊娠诊断，这对于保胎，减少空怀，缩短产仔间隔，提高繁殖率和经济效益具有重要意义。

表1 配种后21～25d母猪早期妊娠诊断的准确率

总之，用母猪粪便孕酮酶免疫法进行早期妊娠诊断，快速，准确，收集样本方便，此外，并不需要任何特殊的设备或技术。因此，母猪粪便孕酮酶免疫法进行早期妊娠诊断有较高的临床适用性，更有利于在养猪场（户）中推广和应用。

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[2]董武子，窦忠英.粪尿类固醇激素检测在野生动物繁殖研究中的应用[J].黑龙江畜牧兽医,2003(11):65-66.

[3]MasaharuM,KouyaN,TadatoshiO,eta1.Measurem en tofGestagenConcen trationinEar lyPregnancyDiagnosisintheSow[J].J.Vet.Med.Sci，1997，59(8):695-701.

[4]冯建刚，李岩，龚新明,等.母猪粪便孕酮酶免疫测定法的建立及其初步应用[J].畜牧与兽医，2013，45(9):37-39.

[5]HulténF.ZhangBR,ForsbergM,eta1.App lyingaprogesteroneassaytofeca lsam p lesco llectedfromsow sduringtheoestrouscycle[J].Rep rod. Dom.Anim，1995，30:101-105.

[6]杨利国，谢成侠，沈家森，等.孕酮酶免疫测定试剂盒的研制及其在家畜繁殖上的应用[J].南京农业大学学报，1988，11（4）：61-66.

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