犬红细胞抗原1.1血型多克隆抗体的制备与鉴定

杜国浩，李华涛，李守军

（华南农业大学兽医学院，广东 广州510642）

犬的血型在1910年第一次被发现[1]。犬和人一样有很多种血型，现在国际上公认的有8种血型，这些血型分别命名为犬红细胞抗原1（DEA 1）、DEA 3、DEA 4等[2]。其中DEA 1有4个亚型：1.1、1.2、1.3和阴性[3]。学者认为DEA1血型为等位基因决定，DEA 1.1、1.2、1.3和阴性不会在犬上同时出现[4]。DEA1.1是在犬中最常见也是最重要的血型，有研究用蛋白质印迹方法检测出DEA1.1为两个膜蛋白，大小分别为50 kD和200 kD[5]。犬不含DEA1血型的天然抗体，首次输血不会因血型不符发生严重的输血反应，但再次输血时，犬因血型错配会发生输血反应，严重时甚至致命，其中DEA 1.1的输血反应最迅速也最剧烈[6-7]。因此，在输血时应特别注意DEA1.1血型是否相配，DEA 1.1阳性受血犬可接受DEA 1.1阳性或阴性血液，DEA 1.1阴性受血犬可接受DEA 1.1阴性血液。

美国、澳大利亚等发达国家已有动物血库，是以中央血库的形式建立，并且有相应完善的血型检测程序。国内没有相应的动物血库，在兽医临床上输血也很少测血型，只是临时找供血犬，输血前进行简单的交叉配血试验，少数测血型也是依靠国外进口检测试纸或者抗体，但进口试纸与抗体价值不菲，给国内兽医临床的输血治疗造成了巨大的阻力。本研究旨在制备DEA1.1血型多克隆抗血清，用于兽医临床宠物犬输血前DEA1.1血型鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 QuickVet®/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test，DEA 1.1，DEA3，DEA 4、DEA 7多抗，购自加利福尼亚国际动物血液资源库；EDTANA2，抗犬IgG抗体，购自奥博森公司，木瓜蛋白酶，酶标抗犬IgG二抗，pH 7.2 PBS。

血型检测及判定方法：严格按照快速检测卡说明书操作：抽取全血直接检测，结果与阴阳性对照比对。

抗球蛋白试验法：2%红细胞悬液与1∶200多抗100μL等体积混匀，放37℃温箱中30min，再用pH 7.2 PBS洗涤两次，离心弃上清，加1∶200抗犬IgG抗体100μL混匀，在37℃温箱静置30min，观察结果。

酶处理法：2%木瓜蛋白酶的PBS与压积红细胞2∶1的比例混匀，放置37℃温箱孵育30min，3 000 r/min离心5min，弃上清，加PBS洗涤，反复3次，取处理的压积红细胞与PBS配置成2%红细胞悬液，用1∶200多抗与悬液100μL等体积混匀，37℃温箱中静置30min，观察结果。

血凝试验均用2 mL U型EP管进行，管底有块状沉淀着为凝集，均匀状态者为不凝集，斜放观察凝集为固定状态，不凝集为流淌状态。

1.2 试验动物及样本采集 经DEA1.1血型鉴定为强阳性本地犬提供红细胞血型抗原，阴性的比格犬作为制备多抗的试验犬。分别采集广东本地犬30只，试验用比格犬10只，多个品种宠物犬20只和藏獒犬8只抗凝血样本。血液样本3 000 r/min离心5 min，弃上清与白细胞层，加PBS洗涤3次，用PBS配置成2%红细胞悬液，用于制备多抗符合率检测。

1.3 多抗的制备

1.3.1 抗原制备与试验动物的选择 用血型检测卡检测筛选DEA1.1阴阳性犬用于试验，并检测DEA1.1，DEA3，DEA 4和DEA 7，排除其他血型干扰。无菌分离阳性血型犬红细胞，pH 7.2 PBS制备成50%红细胞悬液，作为抗原，阴性血型比格犬作为被免疫动物。

1.3.2 免疫程序 初免经静脉、腹腔分别注射3mL抗原。14 d后二次免疫，抗原量同首免相同。以后每隔7 d用2mL抗原加强免疫，共免疫5次，最后1次免疫7 d后采血分离血清。

1.4 多抗的鉴定

1.4.1 阴阳性红细胞鉴定 自制多抗用PBS稀释100倍，分别用2%的DEA1.1阴阳性红细胞做抗球蛋白试验，观察血凝结果。

1.4.2 血凝效价鉴定 自制多抗用PBS稀释从100～2 000倍，间隔100倍，用2%的DEA1.1阳性红细胞做抗球蛋白试验，观察结果，记录血凝效价。

1.4.3 符合率统计 分别用200倍稀释的进口DEA1.1多抗和自制多抗对采来的68只犬的红细胞进行血型鉴定，两组结果进行比对，得出自制多抗与进口多抗鉴定效果。

2 结果

2.1 抗原的确定 用快速检测卡鉴定到并用于试验的1只DEA 1.1阳性广东本地犬和1只DEA 1.1阴性比格犬，如图1，2。并用DEA 1.1，DEA3，DEA 4，DEA 7多抗对两只犬的红细胞分别进行抗球蛋白试验，结果显示DEA 1.1分别为阳性和阴性，其余血型除DEA4为阳性外，均为阴性，证明了进口多抗的有效性，并排除了其他血型的干扰。

图1 DEA 1.1阴性犬血型

图2 DEA 1.1阳性犬血型

2.2 多抗鉴定

2.2.1 抗球蛋白试验结果 DEA 1.1阳性红细胞阳性，DEA 1.1阴性红细胞阴性。

本研究所制多抗与进口多抗符合率达98%。如表1。血凝效价试验，鉴定结果显示，血凝效价为1 800倍，约为211。

2.2.2 酶处理试验结果 DEA 1.1阳性红细胞阳性，DEA 1.1阴性红细胞阳性。

采集的68份临床样本全部都是阳性。

3 讨论

传统的多抗制备方法[8]，运用原核表达或多肽合成法获取抗原。本研究在抗原未知且不能纯化的情况下，用DEA 1.1阳性红细胞作为血型抗原，免疫同种DEA 1.1阴性犬，排除异种之间产生非特异抗体的可能。本研究用DEA 1.1进口多抗与自制多抗效果进行比对，发现在广东地区68只犬中只有1只本地土狗结果不符合，并且这1只犬红细胞用自制多抗检测为阴性，而进口多抗检测为阳性，这有可能因为自制的多抗比进口多抗对于DEA1.1抗原更加特异。抗球蛋白试验显示自制多抗与进口多抗的符合率高达98%。说明按照我们的方法制备的DEA1.1血型多克隆抗血清完全可以满足临床犬输血前血型鉴定的要求，并且可以用于临床输血前的血型鉴定。

表1 DEA1.1血型符合率统计情况

有研究表明[9]，在某些病人的血清中存在某些抗体能凝集木瓜蛋白酶处理过的红细胞，称为唯酶抗体，该类抗体可凝集自身红细胞，同型红细胞及所有阴性红细胞，致使酶处理过的红细胞血型检测结果不准确。本研究制作的多克隆抗体能与所有木瓜蛋白酶处理过的红细胞反应。说明所制备的多克隆抗血清中含有唯酶抗体，原因未知。但是唯酶抗体仅仅对经过酶处理的红细胞有反应，并不影响抗球蛋白试验的结果，本研究制备的多抗可以有效的鉴定DEA1.1血型，但是需要注意的是不能鉴定用木瓜酶处理过的红细胞。

本研究中调查显示，广东地区各品种犬的DEA 1.1血型阳性率有很大差异。值得注意的是广东本地犬的DEA1.1阳性率高达83%，高于其他纯种宠物犬。在国内兽医临床输血中，多用本地的大中型本地犬为供血犬，这给临床输血治疗带来很大的风险。本研究还是首次对国内广东地区本地犬的血型频率进行调查，对于广东本地犬的临床输血有很大的指导意义。

本研究成功制备了DEA 1.1血型多克隆抗体，经符合率比对后确定有效，并具有高血凝效价。DEA 1.1多克隆抗体的制备为国内犬血型检测提供了保障，为DEA 1.1血型单克隆抗体的制备及进一步研究DEA 1.1抗原结构打下了良好的基础。

[1] Swisher S N，Young L E.The blood grouping systems of dogs[J].Physiol Rev，1961，41：495-520.

[2] Vriesendorp H M，Albert E D，Templeton JW，et al.Joint report of the second international workshop on canine immunogenetics[J].Transplant Proc，1976，8：289-314.

[3] Symons M，Bell K.Expansion of the canine A blood group system[J].Anim Genet，1991，22：227-235.

[4]Stormont C.A note on linear subtyping relationships.Papers dedicated to Johannes Moustgaard on the occasion of his 70th birthday，26 September 1981[J].Copenhagen：Royal Danish Agricultural Society，1981，190-193.

[5]Andrews G A，Chavey P S，Smith J E.Production,characterization,and applications of a murine monoclonal antibody to dog erythrocyte antigen 1.1[J].J Am Vet Med Assoc，1992，201：1549-1552.

[6]Giger U，Gelens C J，Callan M B，et al.A.An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocytic antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog[J].JAm Vet Med Assoc，1995，206：1358-1362.

[7]Young L E，Ervin D M，Yuile C L.Hemolytic reactions produced in dogs by transfusion of incompatible dog blood and plasma.1.Serologic and hematologic aspects[J].Blood，1949，4：1218-1231.

[8]贾慧娜，罗海玲.多克隆抗体制备方法的研究进展[A].中国畜牧兽医学会养羊学分会2012年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C].横山：中国畜牧兽医学会养羊学分会，2012：66-69.

[9]马曙轩，刘景汉，欧阳锡林，等.唯酶红细胞抗体的血型血清学特性的研究[J].中国实验血液学杂志，2003，5：527-529.