FS H 对体外培养仔猪睾丸支持细胞CyclinA 2表达的影响

张会琼，孙 思，张姣姣，王 怡，王鲜忠，张家骅

（西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 北碚400716）

睾丸支持细胞的增殖能力是决定雄性动物生精能力的重要因素，促卵泡素（FSH）是调节睾丸支持细胞增殖最重要的激素。Walker 等[1]和我们前期的研究发现，在睾丸支持细胞中，FSH 与受体结合后，能通过激活cAMP-PKA、Ca2+、ERK 等多条信号通路调节支持细胞的增殖，但具体影响哪些基因的表达还不清楚。细胞中的细胞周期素A（Cyclin A）控制着细胞DNA 合成的起始，其表达量的变化对于细胞周期的进程有着十分重要的影响[2]，Cyclin A2 主要表达于各类体细胞[3]，是细胞周期素依赖的蛋白激酶1（Cyclin-dependent kinases，Cdk1）及Cdk2 的调节亚基，启动并控制着DNA 的复制[4]。FSH 是否可以通过影响CyclinA2 的表达进而影响睾丸支持细胞的增殖仍不清楚。本试验利用体外培养的仔猪睾丸支持细胞，研究FSH 是否通过cAMP、Ca2+内流和ERK1/2调节CyclinA2表达的机制，为进一步认识FSH调节体外培养仔猪睾丸支持细胞增殖的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验材料 DMEM／F-12 Hams、胎牛血清和VI 型胶原酶（Gibco 公司）；胰蛋白酶、FSH、Foskolin、U0126 和RP-cAMP（Sigma 公司）；Ca2+通道抑制剂Verapamil（ALEXIS），荧光定量PCR 试剂及SYBR GreenⅠ（Invitrogen）；RNApreP pure cell 总RNA提取kit 和TIANScript RT Kit（TIANGEN BIOTECH）；其余均为国产分析纯，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。仔猪睾丸采自重庆本地2～3 周龄长白仔猪。

1.2 细胞培养 仔猪睾丸支持细胞的分离培养方法按我们前期建立的方法进行[5-6]。

1.3 不同浓度的FSH 对CyclinA2 mRNA 表达的影响 细胞培养至48 h 左右用不同浓度的FSH（0-100 ng/L）处理30 min，收集细胞提取RNA，检测CyclinA2 mRNA 的丰度。

1.4 FSH 作用不同时间对CyclinA2 mRNA 表达的影响 细胞培养至48 h 左右用FSH（50 ng/mL）处理0，5，30，60，90 min，收集细胞提取RNA，检测CyclinA2 mRNA 的丰度。

1.5 cAMP、Ca2+对FSH 诱导CyclinA2 mRNA 的丰度表达的影响 细胞培养至48 h 左右，用FSH（50 ng/mL）、Foskolin（10 μmol/L），RP-cAMP（10 μmol/L）或Ca2+通道抑制剂Verapamil（0.05 mg/mL）处理30 min，RP-cAMP 或Verapamil 在FSH 处理前2 h 加入，收集细胞提取RNA，检测CyclinA2 mRNA 的丰度。

1.6 ERK1/2 对FSH 诱 导CyclinA2 mRNA 表达的影响 细胞培养至48 h左右，用FSH（50 ng/mL）、U0126（10 μmol/L）、FSH+U0126 处理30 min，并作空白对照，U0126 在FSH 处理前2 h 加入，收集细胞提取RNA，检测CyclinA2 mRNA 的丰度。

1.7 荧光定量PCR 将收集的细胞用RNApreP pure cell 总RNA 提取kit 进行总RNA 提取，并通过电泳进行RNA 纯度鉴定。用TIANScript RT Kit 进行逆转录反应，18S rRNA作为内参照进行实时荧光定量PCR分析，每个样品设3 个重复，具体方法按试剂盒的说明书进行。引物信息如表1。

表1 引物序列

1.8 统计分析 每组数据设3 个重复，结果以X±SE表示，用SPSS 16.0 One way ANOVA 和Tukey′s post hoc test 进行统计分析，P＜0.05 确定为差异显著，图中不同的字母表示差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度的FSH对CyclinA2 mRNA 表达的影响

从图1 可以看出，在0-50 ng/mL 内，随着FSH 浓度的增加，CyclinA2 mRNA 的表达明显增强（P＜0.05）；当FSH浓度为50 ng/mL，CyclinA2 mRNA的表达量与对照相比增加了8.58 倍，但是当FSH浓度增加到100 ng/mg 时，CyclinA2 mRNA 的表达量与加入FSH 前相比只增加了8.38 倍（P＜0.05）。

图1 不同浓度的FS H 对C yclinA 2mR NA 表达的影响

2.2 FSH 作用不同时间对CyclinA2 mRNA 的影响

从图2 可以看出，作用15 min 后，CyclinA2 的表达量增加了4.86 倍（P＜0.05）；30 min 时与对照相比，CyclinA2 的表达量增加了9.03 倍（P＜0.05）；此后CyclinA2 的表达量有所下降，到90 min 时，CyclinA2的表达量仅为对照的4.38 倍（P＜0.05）。

图2 FS H 作用不同时间对C yclinA 2mR NA 的影响

2.3 cAMP、Ca2+在FSH 诱导支持细胞表达CyclinA2 mRNA中的作用 从图3 可以看出，Forskolin 显著促进了CyclinA2的表达，与对照相比增加了8.87倍（P＜0.05），但与单独的FSH作用无显著差异（P＞0.05）。Rp-cAMP、Verapamil 降低了FSH 诱导的支持细胞的CyclinA2 mRNA 的表达，与仅加入FSH 相比分别降低了27.97%、32.90%（P＜0.05），同时加入Rp-cAMP、Verapamil 抑制作用明显增强，CyclinA2 mRNA 的表达量与仅加入FSH 相比下降了61.26%（P＜0.05），单独添加Rp-cAMP、Verapamil 对CyclinA2 mRNA 的表达无明显影响（P＞0.05）。

2.4 ERK1/2 在FSH 诱导CyclinA2 mRNA 表达中的作用 从图4 可以看出，单独添加ERK1/2 的抑制剂U0126 与空白相比对CyclinA2 的表达无显著差异（P＞0.05），当U0126 与FSH 共同作用时显著抑制FSH 诱导的CyclinA2 的表达，与仅有FSH 作用时相比降低了45.09%（P＜0.05）。

图3 cA M P、C a2+在FS H 诱导支持细胞表达C yclinA 2mR NA 中的作用

图4 ER K 1/2在FS H 诱导支持细胞表达C yclinA 2mR NA 中的作用

3 讨论与结论

体内试验表明，FSH 能够促进仔猪睾丸支持细胞的增殖[7-8]。本试验发现，FSH 以剂量和时间依赖的方式促进睾丸支持细胞CyclinA2 mRNA 的表达，并且在50 ng/mL、作用30 min 时到达高峰；随着FSH浓度和作用时间进一步增加，其表达量反而呈下降趋势，这可能与FSH 在不同浓度和时间的条件下激活cAMP-ERK1/2 等信号通路，而ERK1/2 在细胞周期中的活性具有一定的周期性有关[6-9]，这与FSH 能通过激活cAMP-PKA、Ca2+、ERK 等多条信号通路促进支持细胞的分裂增殖相一致[9]。

本试验中添加cAMP促进剂Forskolin（10 μmol/L）使CyclinA2 mRNA的表达量增加，而加入cAMP 的抑制剂Rp-cAMP 则使CyclinA2 mRNA 的相对表达量下降，这表明FSH 通过影响细胞中cAMP 的水平，进而诱导了CyclinA2 的表达，这与我们前期的研究结果显示细胞内一定浓度的cAMP 能调节Rb 的磷酸化，进而影响细胞的增殖有关相一致[9]。

Ca2+内流在FSH 调节睾丸支持细胞功能中发挥了重要作用[9]。本试验中，在FSH 处理细胞前加入Ca2+通道抑制剂Verapamil 后，CyclinA2 mRNA 的表达量降低，这表明Ca2+可能参与了FSH 调节CyclinA2 mRNA 的表达过程。而同时添加Rp-cAMP 和Verapamil 后，CyclinA2 的表达量降低得更明显，表明cAMP-PKA途径和Ca2+通道途径对FSH调节CyclinA2 mRNA 表达可能具有协同作用，这与我们前期试验发现Rp-cAMP 和Verapamil 在ERK1/2 的激活和细胞增殖方面具有一定协同效应的结果相一致[9]。

试验结果还发现，ERK1/2 的抑制剂U0126 显著抑制了FSH 诱导CyclinA2 的表达，这表明ERK1/2 途径也参与了FSH诱导CyclinA2 的表达。这可能是因为FSH能够引起ERK1/2的磷酸化，而加入U0126后，阻断了ERK1/2的活性，进而抑制Rb的磷酸化所致。我们前期的研究也表明，在仔猪睾丸支持细胞中，FSH主要通过MEK-ERK-RSK级联的途径激活ERK1/2，而且ERK1/2参与了细胞增殖的调节[9]。因此，FSH能够诱导支持细胞产生较低水平的cAMP,cAMP 可以激活细胞内的ERK1/2，活化的ERK1/2 可能影响Rb 磷酸化和后续翻译水平，从而促进了CyclinA2 mRNA 的表达。

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