针刺对MCAO 大鼠脑组织小胶质细胞活化及炎症介质含量的影响

韩冰冰，卢 岩，赵海军，王 媛

免疫炎症反应促进了脑缺血后的继发性脑损害，而中枢神经系统最主要的免疫效应细胞-小胶质细胞的活化则是脑缺血免疫炎症反应的关键始动因素。有研究报道，针刺可以抑制脑缺血后的炎症反应，调控炎性介质释放［1］。那么针刺对于脑缺血发挥抗炎作用是否与小胶质细胞的活化有关?本研究建立MCAO 大鼠模型，从小胶质细胞活化的调控的角度探讨针刺抗炎发挥脑保护作用的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF 级Wistar 大鼠40 只，雄性，体重(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量许可证编号:SCXK(京)2012-0001。

1.2 实验仪器 全自动酶标仪，RT-2100C 型，深圳雷杜Rayto 公司;激光共聚焦显微镜，LSM510型，德国Zeiss;Image pro plus 4.5 图像处理系统，美国Media Cybernetics 公司。

1.3 实验试剂 小鼠IBA1 抗体，购自Abcam;FITC 标记山羊抗小鼠IgG 及免疫染色固定液、封闭液、洗涤液、稀释液、封片液均购自碧云天生物技术有限公司;EDTA 抗原修复液，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 模型复制及分组 采用大脑中动脉栓塞法制成局灶性脑缺血模型［2］。大鼠苏醒后进行神经功能缺损评分，1～3 分为造模成功，随机配伍分为模型对照组、内关组、曲池组、地机组，每组样本量均为8。另取8只动物颈总动脉插线仅1 cm 为假手术对照组。

1.5 针刺方法 曲池穴直刺进针4 mm，内关穴直刺进针1 mm，地机穴直刺进针4 mm。疏密波2/15 Hz，输出电流1 mA。自造模后第2 天开始，每日于固定时间针刺一次×30 min，连续5 d。

1.6 Zea Longa 神经功能缺损评分标准 见相关文献［3］。

1.7 动物处死及取材 各组动物分别在针刺5 d 结束后2 h，处死取脑，大脑沿冠状面剖为两半，取前半部分置于液氮冻存，后半部分多聚甲醛固定，石蜡切片。

1.8 HE 染色检测脑海马神经元坏死率 光学显微镜(400×)观察大鼠缺血侧海马的CA3区，以细胞出现浓染、核固缩、核碎裂为阳性细胞，每张切片选取5 个不同的视野，计算每个视野内的阳性细胞占全部神经元的百分率，取平均值。

1.9 酶联免疫法检测脑组织炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 取缺血侧脑组织制备脑组织匀浆，按照试剂盒说明操作。

1.10 IBA1 免疫荧光染色检测小胶质细胞活化 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，洗涤5 min×3次。EDTA 抗原修复95 ℃水浴10～15 min，固定10 min，去固定液，洗涤5 min×3 次，吸尽液体。封闭60 min，去封闭，加一抗(1∶200)，湿盒4 ℃孵育过夜。去除一抗，洗涤5 min×3 次。加二抗(1∶500)，室温避光60 min，洗涤5 min×3 次。封片液中加入DAPI 混匀，封片，激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光。每组选5 张切片，高倍镜(400×)下每张切片随机取5 个视野，采用IPP 图像分析软件测定IBA1 阳性表达的平均光密度(OD)值，取均值作为该切片IBA1 的表达水平。

1.11 统计学方法 应用SPSS13.0 统计学软件处理数据，检测结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异具有显著性。

2 结果

2.1 针刺对大鼠神经体征评分、脑海马神经元坏死率的影响 与假手术对照组相比，各组大鼠神经体征评分、脑海马神经元坏死率均明显升高(P＜0.01);与模型对照组相比，内关组、曲池组、地机组大鼠神经体征评分明显降低(P＜0.05);与模型对照组相比，内关组、曲池组脑海马神经元坏死率明显降低(P＜0.05);与地机组相比，曲池组脑海马神经元坏死率明显降低(P＜0.05)(见图1)。

2.2 针刺对MCAO 大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影响 与假手术对照组相比，模型对照组TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明显升高(P＜0.01);与模型对照组相比，曲池组TNF-α、IL-6 含量明显降低(P＜0.05);内关组、曲池组IL-1 含量明显降低(P＜0.05)(见图2)。

2.3 针刺对MCAO 大鼠脑组织小胶质细胞活化的影响 假手术对照组IBA1 表达低弱，小胶质细胞呈现静息状态，为分支状;而模型对照组小胶质细胞呈现活化状态，表现为胞体肥大，突起缩短，分支变少，IBA1 表达增强。与假手术对照组相比，各组IBA1 表达明显升高(P＜0.01);与模型对照组相比，内关组、曲池组IBA1 表达明显降低(P＜0.01);与地机组相比，内关组、曲池组IBA1 表达明显降低(P＜0.01)(见图3)。

图针刺对MCAO 大鼠神经体征评分、脑海马神经元坏死率的影响

图2 针刺对MCAO 大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影响

3 讨论

目前许多研究均支持免疫性炎症反应参与了缺血性卒中后的脑损伤。脑缺血后数小时，受损脑区域的炎症反应开始启动，持续数天，使脑缺血所致的迟发性脑损伤加重、神经细胞的生物学功能预后更差，而中枢神经系统最主要的免疫效应细胞-小胶质细胞，则是免疫性炎症反应的关键始动因素［4］。

生理情况下小胶质细胞占脑细胞总数的5%～10%，为脑中数量居第3 位的重要的免疫细胞。小胶质细胞最显著的特点之一是对外界环境刺激非常敏感，是第一个针对损伤产生的应答细胞，可在局灶性脑缺血48～72 h 内出现增殖高峰并可持续存在数周。小胶质细胞构成脑内的固有免疫系统，被激活后从分枝状变成阿米巴状，突起缩短、胞体肥大，形态类似巨噬细胞。激活的小胶质细胞可以过吞噬清除病原体和细胞碎片以及分泌抗炎物质、神经生长因子等，有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活，发挥神经营养作用［5］。然而，当免疫介质失控而无限扩大时，小胶质细胞则通过释放和分泌一系列潜在的神经毒性物质、炎性因子和酶导致继发性脑损害［6］。因此，如何抑制小胶质细胞的过度活化，将炎症反应控制在适当水平，将为脑缺血的治疗提供新的途径。IBA1 是能与小胶质细胞发生特异性结合的钙结合蛋白，当小胶质细胞激活后，IBA1 的表达量上调，因此IBA1 通常作为鉴定小胶质细胞的标记物使用［7］。

图3 针刺对MCAO 大鼠脑组织IBA1 表达的影响(免疫荧光×400)

本研究结果显示，针刺内关、曲池均能显著降低MCAO 大鼠的神经体征评分、脑海马神经元死亡率，并且能明显抑制脑缺血后IBA1 的异常表达，抑制小胶质细胞的活化，降低脑缺血后脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的异常升高。这提示针刺抗炎发挥脑保护作用的机制与对小胶质细胞活化的调控密切相关，本研究为进一步探讨针刺调控小胶质细胞活化的分子机制提供了依据和基础。

［1］秦文熠，罗 勇，余 超.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马内白介素-1β 及转录核因子κB 抑制蛋白激酶的影响［J］.针刺研究，2013，38(04):271-276.

［2］Yan Lu，Bingbing Han，Shijun Wang.Effects of electroacupuncture on microcirculatory blood flow and glucose transporter function in the hippocampus［J］.Neural Regen Res，2011，6(3):200-205.

［3］王 媛，赵海军，卢 岩，等.针刺对MCAO 大鼠神经功能恢复及脑微循环血流量的影响［J］.江苏中医药，2013，45(7):70-72.

［4］Weinstein J，Koerner I，Mller T.Microglia in ischemic brain injury［J］.Future Neurol，2010，5(2):227-246.

［5］Hendryk S，Czuba Z，Jedrzejewska-Szypulka H，et al.Increase in activity of neutrophils and proinflammatory mediators in rats following acute and prolonged focal cerebral ischemia and reperfusion［J］.Acta Neurochir Suppl，2010，106:29-35.

［6］Lin HY，Tang CH，Chen JH，et al.Peptidoglycan induces interleukin-6 expression through the TLR2 receptor，JNK，c-Jun，and AP-1 pathways in microglia［J］.Cell Physiol，2011，226(6):1573-1582.

［7］Chatterjee D，Biswas K，Nag S，et al.Microglia play a major role in direct viral-induced demyelination［J］.Clin Dev Immunol，2013，13:1-12.