可乐定对永久性脑梗死大鼠的神经保护作用及对神经干细胞增生的影响

朱 琳，李建成，马东明，姜正林，李永财，何 鹏，许世辉

α2 肾上腺素受体激动剂可乐定临床上作为中枢性降压药使用。一些研究表明，α2 受体激动剂能拮抗低氧、脑缺血、兴奋性毒性引起的脑损伤，缩小脑梗死体积，能通过延长抽搐和死亡的潜伏期达到拮抗严重的急性缺氧引起的脑损伤［1～3］。若使用α2-受体阻滞剂，则会增加重型缺氧的早产胎羊的神经元损伤［1］。Dean 等利用早产胎羊脐带阻断缺血模型的研究显示，可乐定(10 μg/kg/h)治疗可以增加存活的神经细胞数［1］。Hang 发现脑缺血前6～24 h给予可乐定(40 μg/kg)预处理，可改善神经功能评分并减少梗死范围，而同时使用α2 受体阻滞剂拮抗可乐定的这一神经保护作用［2］。叶春玲等研究表明，可乐定可提高小鼠和猫脑缺血缺氧后的动物存活率和脑电活动［3］。

因此，本研究通过制备大鼠永久性脑梗死模型(permanent middle cerebral artery occlusion，PMCAO)，使用可乐定治疗，观察大鼠神经功能恢复情况，测量脑梗死体积，尼氏染色后进行神经细胞计数，BrdU-nestin 免疫荧光双标检测增生的神经干细胞数目以及采用ELISA 方法检测神经再生相关因子在脑组织中的表达，进一步探讨可乐定的神经保护作用，并观察其对神经干细胞增生的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1 动物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠120只，SPF 级，体重260～280 g，由南通大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(苏)2008-0010。

1.2 动物分组及药物使用 大鼠采用随机数字表随机分组。于术后3 h 开始腹腔注射给药，每24 h 一次，连续使用5 d，或至实验终点。缺血对照组给予等剂量的生理盐水(1 ml/kg)，假手术组不注射药物或生理盐水。实验过程中，大鼠因麻醉意外、缺血损伤等原因死亡16 只，其实验数据未纳入统计。各处理组大鼠死亡率无显著差异。实验分组情况，神经行为与细胞计数实验:假手术组(8 只)、缺血对照组(10 只，死亡2 只)、可乐定治疗50 μg/kg组(10 只，死亡2 只)、可乐定治疗100 μg/kg 组(10只，死亡2 只);梗死体积测定:假手术组(9 只)、缺血对照组(11 只，死亡2 只)、可乐定治疗50 μg/kg组(11 只，死亡2 只);神经再生相关因子测定:假手术组(6 只)、缺血对照组(7 只，死亡1 只)、可乐定治疗50 μg/kg 组(7 只，死亡1 只);干细胞增生检测:假手术组(9 只)、缺血对照组(11 只，死亡2只)、可乐定治疗50 μg/kg 组(11 只，死亡2 只)。

1.3 试剂及仪器 可乐定、氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma 公司，尼龙栓线(北京生物沙东生物技术有限公司)，动物恒温手术台(MA22 苏州市苏杭实验动物设备厂)，冰冻切片机(Laica CM1900，德国)，数码相机(Cannon Powershot S60，日本)，大鼠NGF、NCAM-L1、TN-C、GDNF、Nogo-A 的ELISA检测试剂盒(上海继锦化学科技有限公司)，荧光显微镜(Leica 319861，DM4000B)，酶标仪(Elx-800，美国 Bio-TEK 公 司)，5-Bromo-2 ’-Deoxy Uridine(B5002，Sigma)，Anti-nestin antibody produced in rabbit(N5413，Sigma)，Fluorescein(FITC)-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse IgG(Jackson)，Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat(Sigma)。

1.4 缺血模型制备 参照Lorenz(2009)改良方法，采用线栓法制作PMCAO 模型。予10%水合氯醛(0.35 g/kg，i.p)麻醉大鼠后，取颈部正中线切开，分离大鼠右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，用0 号缝合线结扎CCA近心端及ECA 起始部，夹闭ICA，在CCA 上作一小切口，栓线(直径0.18 mm)从CCA 插入ICA，深度距ECA 分叉处为(18.5±0.5)mm，有阻挡感，此时栓线即穿过MCA 起始段并达到大脑前动脉(ACA)近端。固定栓线并结扎，缝合皮肤。假手术组栓线插入深度为1 cm，其余步骤同前。动物苏醒后缺血对侧肢体痛觉刺激缺失及运动障碍视为模型成功。

1.5 神经行为学评分 参照MNSS(modified neurological severity scores)18 分制评分法综合性评分，反映大鼠运动、感觉、反射及平衡功能。13～18分提示严重损害;7～12 分提示中度损害;1～6 分提示轻度损害，正常动物为0 分。在术前及术后1、2、3、4、5 d 分别对各组动物采用盲法进行行为学检测。

1.6 尼氏染色与神经细胞计数 大鼠术后5 d，深度麻醉下暴露心脏，穿刺针经心尖部刺入左心室至主动脉根部，固定，剪破右心耳，血液流出，先用350 ml 生理盐水快速冲洗，后用4 ℃的4%多聚甲醛灌注，取脑，多聚甲醛中固定24 h，先后在20%、30%的蔗糖溶液中脱水，切片，尼氏染色，取缺血侧前囟后1.7 mm～2.3 mm 海马CA1区、CA3区、皮质区，高倍镜(×400 倍)下计算各区完整的锥体细胞数，每张切片计数3 个区域，连续取7 张脑片，取平均数为该脑梗死侧CA1区、CA3区、皮质区的存活细胞数。

1.7 脑梗死体积测量 术后3 d，深度麻醉大鼠，断头取脑，去除嗅球放入脑槽，-20 ℃冷冻10 min。从额极到枕极作额状切片，厚度2 mm，脑片置于1%TTC 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，间隔10 min 翻动脑片。后置于4 %多聚甲醛缓冲液中固定，过夜。拍摄的图像以Image pro plus(IPP)软件处理，计算梗死面积(红色为正常脑组织，白色为梗死区)，梗死体积(mm3)=非缺血侧半球体积-缺血侧半球未梗死区体积，脑梗死体积百分比(%)=梗死体积(mm3)/全脑体积(mm3)×100%。

1.8 神经再生相关因子检测 大鼠于术后第6 天，深度麻醉下断头取损伤则脑组织，匀浆、提取蛋白，用BCA 法通过蛋白浓度测定试剂盒行蛋白定量。然后采用大鼠ELISA 试剂盒测定各神经再生相关因子(GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C)的浓度。取出板条复温，先后加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，温浴后彻底洗涤，用底物TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度，后以样品浓度除以总蛋白浓度，最后得出单位总蛋白中所含样品的量。

1.9 BrdU-nestin 免疫荧光双标 于大鼠术后第3、4、5 天分别腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2’-DeoxyUridine，BrdU)溶 液(50 mg/kg，bid))。术后第6 天灌注、取材、固定、脱水、切片，后行BrdU-Nestin 免疫荧光双标检测。BrdU(1∶500，sigma);nestin(1∶100，sigma)。取缺血侧海马区前、中、后部共3 张脑片，用荧光显微镜采集图片，拼合双标图片，高倍镜(×200 倍)下计算皮质缺血损伤区周边、海马CA3区及海马DG 区BrdU-nestin 双标阳性细胞数，该大鼠缺血侧该区域的细胞数为3张脑片的平均值。

1.10 统计学处理 用SPSS19.0 统计软件分析处理数据，所有数据均用均数±标准差(±s)表示，神经功能缺损评分采用秩和检验;其余数据采用单因素方差分析，两两比较用Scheffe 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 可乐定减轻大鼠PMCAO 后的脑损伤。

2.1.1 神经行为学评分 假手术组神经功能正常，其神经行为学评分均为0 分，故表1 中未列出。脑缺血大鼠均有不同程度的神经功能缺损症状，其中缺血对照组最严重。与缺血对照组比较，术后第4 天、第5 天，可乐定50 μg/kg 治疗组神经功能缺损症状明显改善(P＜0.01 或P＜0.05)，100 μg/kg 治疗组的作用略好于50 μg/kg 治疗组，但两者之间无统计学差异(见表1)。

2.1.2 神经细胞计数 大鼠PMCAO 后5 d，假手术组海马组织无明显损伤，CA1、CA3区锥体细胞层次清楚，结构完整，尼氏体丰富，细胞核大而圆，核仁明显;皮质部位神经元形态正常，细胞排列较紧密，胞核饱满，核仁清晰。缺血对照组缺血侧海马组织有明显损伤，主要表现在CA1、CA3区大量锥体细胞缺失，残存细胞排列紊乱，形态不规则，尼氏体减少或消失，胞核固缩，核仁欠清;缺血侧皮质部着色明显变淡，神经元缩小变形，核固缩，尼氏体消失。可乐定50 μg/kg 治疗组和100 μg/kg 治疗组海马与皮质损伤减轻，表现为缺血侧海马锥体细胞排列较整齐紧密，胞核饱满，核仁较清，CA1、CA3区锥体细胞缺失或胞核固缩较少;缺血侧皮质部神经元形态基本完整，尼氏体丰富，胞核饱满，核仁清晰。细胞计数显示，与缺血对照组相比，可乐定治疗组海马CA1区锥体细胞数目增多(P＜0.05 或P＜0.01)，并且100 μg/kg 治疗组多于50 μg/kg 治疗组(P＜0.05，见表2);在海马CA3区，可乐定50 μg/kg、100 μg/kg治疗组锥体细胞数目也明显多于缺血对照组(P＜0.01)，但两个剂量组之间的差异无显著性(见表2);皮质损伤灶周围区域，可乐定治疗组锥体细胞数目明显增多(P＜0.01)，并且100 μg/kg治疗组多于50 μg/kg 治疗组(P＜0.01，见表2)。

2.1.3 梗死体积 术后3 d，TTC 染色红色为非梗死区，白色为梗死区。梗死区与右侧MCA 供血区一致。假手术组未见梗死灶(n=9)，缺血对照组有较大的梗死体积(29.80%±1.64%，n=9)，可乐定(50 μg/kg)治疗组脑梗死体积为(19.15%±1.14%，n=9)，较缺血对照组明显缩小(P＜0.01)。

2.2 可乐定促进大鼠PMCAO 后神经再生相关因子的表达 与假手术组相比，脑缺血损伤后第6 天，缺血对照组及可乐定(50 μg/kg)治疗组大鼠损伤侧脑组织中神经再生相关因子GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C 含量均显著增加，与缺血对照组比较，可乐定组大鼠损伤侧脑组织中上述因子的含量进一步增加，特别是Nogo-A 与TN-C 含量的增加有显著性意义(P＜0.01 或P＜0.05，见表3)。

2.3 可乐定促进大鼠PMCAO 后神经干细胞的增生 脑缺血损伤后第6 天，在大鼠皮质缺血损伤区周边可观察到BrdU 和nestin 双标阳性的细胞。BrdU 可掺入S 期细胞DNA，以此标记可观察细胞增生，结合其它细胞标记物，双重染色，可以反映增生细胞的种类。BrdU 和nestin 共标的细胞可认为是增生的神经干细胞。缺血对照组和可乐定(50 μg/kg)治疗组皮质缺血损伤区周边均可见增生的神经干细胞，分别为15.2±1.3 个(n=9)、22.3±0.3 个(n=9);假手术组为1.0±0.2 个(n=9)。与缺血对照组相比，可乐定组神经干细胞数目的增加更明显(P＜0.01)。

表1 可乐定对大鼠神经行为学评分的影响(±s)

表1 可乐定对大鼠神经行为学评分的影响(±s)

与缺血对照组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 可乐定对海马与皮质神经细胞计数的影响(±s)

表2 可乐定对海马与皮质神经细胞计数的影响(±s)

与缺血对照组比较* P＜0.01;与可乐定50 μg/kg 组比较#P＜0.05，##P＜0.01

表3 可乐定对损伤侧脑组织神经再生相关因子表达的影响(ng/ml，±s)

表3 可乐定对损伤侧脑组织神经再生相关因子表达的影响(ng/ml，±s)

与假手术组比较* P＜0.01;与缺血对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01

3 讨论

文献报道可乐定具有神经保护作用，其机制可能与其抑制脑内去甲肾上腺素的释放有关［1～3］。脑缺血后海马和纹状体等部位释放的去甲肾上腺素会加重损伤，这与其增加神经元对谷氨酸的敏感性，加剧兴奋性毒性有关。本研究发现可乐定治疗可改善pMCAO 大鼠的神经功能缺损症状，减少缺血损伤后神经元的丢失，缩小梗死体积，与文献报导相符。

此外，本研究发现可乐定治疗能促进大鼠损伤侧脑组织中神经再生相关因子-胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、神经细胞粘附分子(NCAM)、神经生长因子(NGF)、髓鞘相关生长抑制因子(Nogo-A)、肌腱蛋白C(TN-C)的表达。文献报道NGF在培养的皮质神经元中能抑制代谢性和兴奋性毒性损伤［4］。长爪沙鼠脑缺血前后，脑室内注射NGF 可以减少海马CA1区迟发性神经元死亡［5］。下调NCAM 导致MCAO 模型小鼠梗死体积增大，加剧神经元损害［6］。静脉注射基因修饰的人骨髓间充质干细胞过表达GDNF，可减轻大鼠脑缺血后的神经功能缺损，缩小梗死体积［7］。在脑出血动物模型，GDNF有神经保护和促进功能恢复的作用［8］。Nogo-A 蛋白导入体外培养的大脑皮质神经元能拮抗外源性过氧化氢引起的氧化应激［9］。因此，本研究结果提示可乐定对脑缺血大鼠的神经保护作用可能与上调上述因子的表达、营养与保护神经细胞、减轻神经细胞损伤有一定的关系。

成年雄性猴注射NGF 能保护梗死皮质神经元，减少退变，促进神经芽生和突触发生［10］。NCAM 可刺激轴突和树突及其分支的生长，稳定突触和促进记忆形成［11］，在神经系统发育、神经再生和突触重塑中发挥重要作用。有文献报道Nogo-A 能抑制轴突生长［12］，但也有人认为Nogo-A 不抑制轴突再生。例如，发育的神经元胞体和轴突表面、轴突的生长锥中均有Nogo-A 表达，但其并未抑制轴突生长，暗示它与轴突生长有关［13］。脊髓损伤后，GDNF 能防止运动神经元变性，促进轴突和髓鞘生长［14］。帕金森病基础和临床研究表明，纹状体中注入GDNF 能阻止黑质多巴胺神经元退变，促进轴突生长。TN-C 对神经细胞的发育、功能形成和对皮质、海马及小脑的神经可塑性有重要作用［15］。在体研究表明，TN-C 沿生长锥伸展分布，诱导轴突生长，可出现在顺行性变性及损伤后再生的神经中。TN-C 还促进有丝分裂活动，外周神经自体移植入丘脑，神经内膜及施万细胞髓鞘内再生的丘脑神经轴索表面可出现大量TNC。因此，可乐定通过增强上述神经再生相关因子的表达，可能会促进神经元突起的生长、突触重塑，改善神经功能缺损症状。

NCAM 在细胞增生、迁移、轴突生长、突触传导和突触可塑性中起重要作用［16］。神经系统中高表达的TN-C 可促进细胞增生、迁移和轴突生长、延长［17］。GDNF 能促进神经元的迁移和分化，与其引起分化相关的基因表达有关。在缺血缺氧新生大鼠模型中植入多能星形胶质干细胞，NGF、GDNF 能促进干细胞的迁移和分化［18］。Nogo-A 调节脑皮质神经元的放射状迁移，Nogo-A 基因敲除小鼠的前脑神经前体细胞放射状迁移受到干扰［19］。本研究发现可乐定治疗组BrdU-nestin 共标的神经干细胞数目明显增多，表明可乐定可能通过促进以上因子的表达，诱导神经干细胞的增生，继而分化为具有功能的神经元，并迁移到相关功能区，修复损伤的脑组织及促进神经功能的进一步恢复，这为临床应用可乐定治疗缺血性卒中提供了重要的实验依据。

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