糖尿病血糖波动实验模型研究进展

王景尚 黄 烨 殷惠军 陈可冀

糖尿病(DM)是继肿瘤、心血管疾病之后发病率居世界第3位的慢性病，严重威胁人类的健康和生命。如何有效遏制糖尿病及其并发症的发生和发展，已成为国内外亟待解决的重大科学问题。良好的血糖控制是防止糖尿病及其晚期并发症的有效途径。流行病学调查证实，糖尿病慢性并发症的发生发展不仅与血糖整体水平升高有关，而且与血糖波动密切相关［1］。血糖波动幅度是独立于HbA1c之外的另一重要的血糖控制评价指标，同时也是糖尿病患者心血管事件发生与死亡的独立危险因素和预测因子［2］。因此，血糖波动相关研究已成为近年来糖尿病及其并发症防治研究的热点之一。

实验模型是连接基础和临床的桥梁与纽带，不仅是进行有效药物筛选及药物作用机制深入研究的重要手段，同时也是深化临床认识，“从临床到实验室，再从实验室到临床”，实现医学转化不可或缺的重要组成部分。近年来，不少学者对糖尿病血糖波动实验模型进行了深入探讨并取得了一定进展，为进一步明确血糖波动对糖尿病的影响及其作用机制提供了实验依据，同时也为药物研发提供了思路。

一、血糖波动的评价标准

评价标准的确立是成功建立实验模型的前提和依据。血糖波动评价标准是糖尿病血糖波动模型成功建立的关键环节。一直以来，HbA1c一直作为评价糖尿病患者血糖控制的金标准［3］。然而，HbA1c值相同并不等于全天血糖谱相同，HbA1c相似的DM患者血糖波动性可能不同［2］。因此，全面认识血糖就必须在重视血糖均值的同时，关注血糖波动性。目前，评估血糖波动性的参数主要从日内血糖波动、日间血糖波动、进餐相关性血糖波动和严重低血糖危险等4个方面进行［4］。日内血糖波动的评价参数包括血糖水平的标准差(SDBG)、最大血糖波动幅度(LAGE)、血糖波动于某一范围的时间百分比、曲线下面积或频数分布、M值和平均血糖波动幅度(MAGE)等。日间血糖波动的评价参数主要包括日间血糖平均绝对差(MODD)和空腹血糖变异系数(FPG－CV)。餐后血糖波动的评价参数包括平均进餐波动指数(MIME)和餐后血糖的时间与曲线下面积增值(IAUC)，严重低血糖危险的评价指标为低血糖指数(LBGI)。在临床应用中，应根据实际需要的不同和参数各自的特点进行合理选择，并将血糖波动幅度与空腹血糖、餐后两小时血糖及HbA1c进行综合考虑，才能全面认识血糖，进而更好地干预和预防糖尿病并发症的发生发展。

二、血糖波动实验模型研究现状

以血糖波动评价标准为依据，研究者在血糖波动模型建立方面进行了一定探索，主要分为细胞和动物实验模型两种。

1．细胞实验模型:目前细胞实验模型均通过间断给予不同浓度的葡萄糖造成日内血糖波动和日间血糖波动，从而模拟机体的血糖波动状态。但由于实验对象和目的的不同，在葡萄糖浓度，波动时间间隔、频率、持续时间以及波动次数上存在一定差异。综合目前研究，主要有以下几种方法:(1)意大利Morpurgo－Hofman衰老研究实验室是全世界最早进行血糖波动细胞实验研究的单位。借助人脐静脉内皮细胞，通过间断给予含有5mmol/L和20mmol/L葡萄糖的培养基，每24h更换1次，采用日间血糖波动的方式建立血糖波动模型，干预14天，血糖波动14次［5］。近10年来运用该模型在波动高糖加重内皮损伤、炎症反应和氧化应激等方面取得了重要进展。(2)Giannini等［6］通过对胎儿神经上皮细胞间断给予含有10mmol/L和20mmol/L葡萄糖的培养基，每24h更换1次，建立血糖波动模型，观察了血糖波动在糖尿病神经病变中的重要作用，干预5天，血糖波动5次。(3)Del Guerra等［7］通过对人胰岛B细胞间断给予含有16．7mmol/L和5．5mmol/L葡萄糖的培养基，每24h更换1次，构建血糖波动模型并证实了格列齐特可显著减轻血糖波动造成的胰岛β细胞的凋亡，干预5天，血糖波动5次。(4)本课题组通过对人脐静脉内皮细胞间断给予低糖型 DMEM(血糖浓度5.0mmol/L)和高糖型DMEM培养基(25．0mmol/L)，每24h更换1次，建立血糖波动模型，研究了PI3K/Akt信号通路在波动高糖损伤内皮中的重要作用及西洋参茎叶总皂苷的保护效应，干预8天，血糖波动8 次［8］。Chen 等［9］采用相同方法探讨了波动高糖对人脐静脉内皮细胞膜硬化的影响，但干预7天，血糖波动7次。(5)侯志强等［10］通过对大鼠胰岛和大鼠胰岛瘤细胞(INS－1)细胞间断给予含有11．1mmol/L和25mmol/L葡萄糖的培养基，每24h更换1次，建立血糖波动模型并探讨血糖波动对大鼠胰岛及INS－1细胞的影响，干预72h，血糖波动3次。Shi等［11］观察了血糖波动对INS－1细胞凋亡的影响，其血糖浓度为 5．5mmol/L 和 33．3mmol/L，每 12h换液一次，观察72h，血糖波动6次。Cheong等［12］观察了血糖波动对INS－1内质网应激的影响，其换液时间、观察时间和波动次数与Shi XL相同，但其血糖浓度为11mmol/L 和 30mmol/L。(6)Sun 等［13］通过对大鼠肾小球间质细胞、人视网膜内皮细胞、血管平滑肌细胞间断给予含有5mmol/L和25mmol/L葡萄糖的培养基，每6h更换1次，建立血糖波动模型，在血糖波动致糖尿病微/大血管病变中的作用机制研究方面取得了丰富成果，干预72h，血糖波动12次［13］。(7)Zhong等［14］观察了血糖波动对人视网膜周细胞的影响，其血糖浓度为5mmol/L和25mmol/L，每48h换液1次，干预8天，血糖波动4次。(8)Masumoto等［15］观察了血糖波动对人胎盘绒毛癌细胞的影响，血糖浓度分别为7mmol/L和42mmol/L，每6h更换1次，观察48h，血糖波动8次。(9)Li－Bo等［16］发现血糖波动具有促进单核细胞促炎细胞因子释放的作用，其血糖浓度为5和15 mmol/L，每12h更换1次，干预72h，血糖波动6次。

2．动物实验模型:糖尿病动物模型包括1型和2型，主要有实验诱导和自发性糖尿病动物模型两大类。其中，自发性1型糖尿病动物模型包括BB大鼠和NOD小鼠，而2型包括ZDF大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠、OB小鼠、T－KK小鼠和NSY小鼠等。实验诱导性模型制备方法包括胰腺切除术诱导法、化学药物诱导法、拮抗胰岛素因子诱导法、食物诱发及催肥等，其中以化学药物诱导法(主要使用链脲佐菌素和四氧嘧啶)操作简单且可行性高，是目前获得实验性糖尿病动物模型最常用的方法，其诱导的动物品系包括大鼠、小鼠、犬、猴和猪等。

目前血糖波动动物模型研究有限，现有模型主要是通过饮食干预造成重复餐后高血糖和胰岛素注射造成大幅度血糖波动而建立的，动物品系仅限于大鼠和小鼠。具体造模方法主要有以下几种:(1)Azuma等是较早进行血糖波动动物模型探索的研究者。通过每日定时两次喂食GK大鼠(非肥胖型的2型糖尿病)的方法诱导重复餐后高血糖而构建血糖波动模型，证实了反复血糖波动具有促进单核与内皮细胞黏附、加重大鼠胸主动脉内皮损伤的作用，血糖波动12周。(2)Watada等在链脲佐菌素(STZ)诱导形成1型糖尿病大鼠模型基础上，通过每日定时两次喂食的方法诱导重复餐后高血糖而建立血糖波动模型，证实了血糖波动在糖尿病大血管病变中的促进作用，血糖波动4周。(3)Mita等［17］应用每日定时两次喂食ApoE基因缺陷小鼠定量麦芽糖的方法诱导反复餐后高血糖制备血糖波动模型，观察血糖波动对ApoE小鼠动脉粥样硬化程度的影响，血糖波动6周。(4)Horváth等［18］基于STZ成功诱导1型糖尿病大鼠模型，通过隔日1次注射60U/kg长效胰岛素造成血糖控制不良(具有大幅度血糖波动)模型(稳定组通过每日1次注射60U/kg中效甘精胰岛素严格控制血糖)，研究发现快速血糖波动具有诱导氧化应激和内皮损伤的作用，血糖波动30天。(5)涂白青等［19］在四氧嘧啶诱导形成糖尿病1型小鼠模型的基础上，通过每日3次腹腔注射2g/kg葡萄糖的方式制备血糖波动模型，观察了血糖波动对小鼠脏器的影响，干预6周。(6)本课题组在高脂饮食联合STZ注射成功制备2型糖尿病大鼠模型基础上，根据造模成功糖尿病大鼠自身的血糖波动性(主要为FPG－CV)进行分组，观察了血糖波动对糖尿病大鼠的影响并对相关机制进行了深入探讨，血糖波动8周［20］。

三、糖尿病血糖波动模型的思考

建立方便实用、可靠性高、重复性好的血糖波动实验模型是进行血糖波动机制实验研究的前提。临床应用是基础实验研究的最终目的和价值体现，因此在实验中选择更加贴近临床的干预条件是实验研究的基本要求之一。

1．选择适当的血糖浓度和干预时间:目前细胞实验研究中高血糖浓度往往在20mmol/L以上，大大超出了一般糖尿病病人的血糖控制范围，同时存在间隔时间过长，干预时间过短，波动次数过少的问题，与临床实际相差较远。因此，适当降低高血糖浓度(如至11．1～16．7mmol/L)，缩短更换培养基时间(6～12小时/次)，增加干预时间(＞7天)更加贴近临床。

应用快速血糖仪测定实验动物血糖，简单便捷，可较快掌握模型动物的血糖波动状态。多数血糖仪上限均在33．3mmol/L，对于超过上限的血糖往往不能显示，加之血糖超过33．3mmol/L时，模型大鼠多伴有高渗性高血糖状态或有肾功能障碍。因此，有必要适当限定模型大鼠空腹血糖和餐后血糖水平。对于空腹血糖最好控制在7．8～16．7mmol/L之间，餐后血糖在11．1～33．3mmol/L之间。干预时间采用定时定量投食的方法，观察时间应根据实验目的的不同进行选择。

2．合理选择造模用动物:糖尿病血糖波动动物模型首先必须是成功稳定的糖尿病动物模型，其次要对不同的干预因素(如饮食干预，药物干预等)反应敏感，模型特征出现迅速且稳定。相对于化学物诱导(如STZ、四氧嘧啶等)的糖尿病动物模型而言，基因缺陷动物模型(如GK大鼠、BB大鼠、NSY小鼠模型等)稳定性相对较好，同时可有效地排除化学物本身对血糖波动的影响，但也存在模型动物成模时间不定、血糖水平不可控和成本昂贵的问题。化学诱导的糖尿病模型成本较低，可控制造模大鼠血糖水平，较易出现血糖水平波动，但稳定性尚需加强。因此，根据实验目的不同，选择合理的实验动物造模对糖尿病血糖波动动物模型的建立至关重要。

此外，目前血糖波动模型用动物均为大鼠或小鼠，尚未有使用猪、犬或猴等进行糖尿病血糖波动模型制备的相关研究，需要在今后研究中加强。随着人源化动物模型(humanized animal models)研究的不断发展，人源化糖尿病小鼠模型也取得了巨大进步。研究人员利用NSG品系小鼠成功培育了遗传上自发及可诱发高血糖的模型，从而可以在存在或缺乏完整的人类免疫系统的情况下进行人胰岛的功能性研究，这也为制备更接近人体生理病理状态的血糖波动实验动物模型，研究血糖波动对人体胰岛功能的影响提供了更好的选择。

3．注重总热量均衡，引入“升糖指数”概念:餐后血糖波动是血糖波动评价的重要参数，同时也是血糖波动模型造模的依据和着眼点。现有的动物模型多采用定时喂食饲料和麦芽糖，腹腔注射葡萄糖或不同时效胰岛素的方式诱导反复的血糖波动，尽管取得了一定的研究成果，但同时也存在诸多缺点，最主要的是总热量不平衡的问题。以上研究中的对照组(血糖稳定组)多采用普通饲料或蒸馏水注射，与波动组大鼠相比，所获得的总热量并不均衡，因此研究结果并不能完全排除总热量差异所带来的影响。“升糖指数(GI)”是反映食物引起人体血糖升高程度的指标，引入该概念可有效克服总热量不同造成的干扰，是建立糖尿病血糖波动动物模型可以尝试的方法。另外，不同时效胰岛素的应用，使治疗作用和血糖波动之间相叠加，在研究药物效应方面缺乏说服力。

4．重视模型自身血糖波动及非糖尿病模型血糖波动:干扰因素的存在是研究血糖波动对机体影响及其机制，建立稳定、可靠、公认的糖尿病血糖波动模型的主要障碍之一。减少干扰因素的最好方法就是尽量不对糖尿病模型大鼠进行干预。本课题组前期在成功制备2型糖尿病大鼠模型后连续两周测定大鼠空腹血糖，根据糖尿病大鼠自身血糖波动性的差异(主要为FBG－CV)将糖尿病大鼠分为波动性高血糖组和稳定性高血糖组，通过数周干预，取得了较好的实验结果［20］。虽然该方法存在实施过程较为复杂、干预时间较长、人力物力耗费过大等诸多缺点，尚需进一步改进，但有效地减少了干扰因素，仍不失为一种值得推荐的方法。在今后的研究中，我们会将模型自身血糖波动性与定时定量投食结合起来，并引入“升糖指数”概念，使该模型进一步完善。

血糖波动幅度增大不仅对糖尿病患者是一种风险，对健康人群亦是如此。因此，我们在关注糖尿病模型血糖波动的同时，对非糖尿病模型的血糖波动也要予以充分重视，包括高脂血症模型(ApoE小鼠)、高血压模型、急性心梗模型以及正常动物。这对于更好探讨血糖波动本身对模型的影响及影响机制具有非常重要的意义。

5．结合中医理论制备糖尿病血糖波动中医证候模型:中医药在糖尿病，特别是2型糖尿病的防治中具有其独特优势，而且这种优势往往不表现在降糖方面，而是在稳定血糖和改善并发症上。如何利用中医理论，制备出符合中医病症特点的糖尿病证候模型，是深入开展中医药防治糖尿病研究的关键所在。目前国内研究者在化学药物诱导出糖尿病动物模型的基础上，运用中药四气五味的药性理论，研制出一些2型糖尿病中医证候模型，如糖尿病肾阴虚模型、气阴两虚模型和阴虚热盛模型等。此外，大量体内外研究证实中医药在稳定血糖方面疗效肯定。然而，符合中医理论的血糖波动证候模型匮乏极大地限制了中医药稳糖机制研究。近来研究显示，血糖波动与情绪和自主神经功能紊乱密切相关。在中医理论中，肝为将军之官，其性主动、喜条达、恶抑郁，与精神、情志及神经内分泌密切相关。肝失疏泄而致肝气郁滞或肝火亢盛均表现为精神、情志及内分泌方面的异常波动。那么是否可以通过对2型糖尿病大鼠进行情志刺激制备糖尿病血糖波动中医证候模型呢?这可能是未来研究的方向之一。

四、展 望

自从血糖波动在糖尿病及其并发症防治中的重要地位被大家认识以来，不少研究者通过深入探索，建立了多种有效的糖尿病血糖波动模型，取得了一定成果，加深了对血糖波动损伤机体及其机制的认识。然而，糖尿病血糖波动实验模型仍存在诸多不足或可探索之处。运用适当的血糖波动浓度、间隔和时间，选择合理的造模动物，注重模型动物总热量摄入平衡，引入“升糖指数”概念，并结合模型自身血糖波动，可能为建立既简便实用、可靠性高、重复性好，又符合临床实际的动物模型提供了思路。中医药在稳定血糖方面疗效确切，中西医结合治疗糖尿病也已被广泛认可，采用多因素、中西医结合方法进行动物造模是今后研究的方向之一。

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