体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

纪慧丽，卢晟盛，潘登科

1. 广西大学动物科学技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；

2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193

体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

纪慧丽1,2，卢晟盛1，潘登科2

1. 广西大学动物科学技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；

2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而，体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平，主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编程，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因组印记、X染色体失活和端粒长度等修饰出现的异常。使用一些小分子化合物以及Xist基因的敲除或敲低等方法能修复表观遗传修饰错误，辅助供体核的重编程，从而提高体细胞克隆效率，使其更好地应用于基础研究和生产实践。文章对体细胞核移植后胚胎发育过程中出现的异常表观遗传修饰进行了综述，并着重论述了近年来有关修复表观遗传错误的研究进展。

体细胞核移植；重编程；表观遗传异常；小分子化合物

Keywords:SCNT; reprogramming; epigenetic errors; small molecules

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)技术是将高度分化的体细胞核移植到去核的卵母细胞中使之构成重构胚，通过将克隆胚胎移植到代孕动物体内后获得与供体细胞具有相同基因组的克隆动物。1997年，Wilmut等[1]首次报道了以成体绵羊乳腺上皮细胞为核供体的克隆羊“Dolly”的诞生，证明了高度分化的体细胞仍具有全能性，激起了各国科学家对体细胞克隆动物的研究热潮。目前，通过体细胞核移植技术已经成功获得了多种哺乳动物的克隆后代[1～6]。 然而，体细胞克隆胚胎的发育能力低，只有一部分的重构胚胎能发育到足月，其中有许多在出生后不久就死亡[6,7]，即使存活的后代也表现出胎盘肥大[8,9]、胎儿过度生长[10]等，这种现象称为“巨胎征”。

造成克隆效率低以及克隆动物各类异常表型的主要原因之一是表观遗传修饰在克隆胚胎早期发育阶段的异常重编程[11]。体细胞核在卵胞质中发生重新编程，转变为一种全能的胚胎状态，这其中包含了复杂的表观遗传修饰，包括染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰、X染色体失活和印记基因表达等。体细胞重编程在哺乳动物和克隆胚胎的发育过程中，对建立核的全能性起关键作用。研究证明，供体细胞核的不完全重编程造成错误的表观遗传，引起相关基因的异常表达，最终影响克隆胚胎的发育[12]。为了提高克隆动物的制备效率，科研人员尝试多种方法来提高克隆效率，例如改良去核程序[13]、优化重构胚的激活[14]、供体细胞的化学处理[15]、连续两次核移植[16]，但是与正常受精的胚胎相比，克隆动物制备效率仍然很低，而且在不同物种中存在很大的差异。本文主要对克隆胚胎中错误的表观遗传修饰以及如何修复进行了综述。

1 体细胞核移植过程中异常的表观遗传修饰

1.1 DNA甲基化

体细胞克隆动物普遍存在 DNA甲基化水平过高的现象，主要表现在去甲基化不充分和提前甲基化。克隆牛胚胎的基因组去甲基化发生时间跟正常胚胎几乎相同，在 2-细胞期达到最低，随后出现过早重新甲基化，甲基化水平上升；体细胞基因组在核移植后基因组去甲基化的程度较受精胚胎低，其DNA甲基化水平明显高于正常胚胎的水平而更接近于体细胞状态[17]。Dean等[18]检测克隆牛桑椹胚处于细胞分裂中期的细胞核，发现了较高的甲基化水平，在4～8细胞期重新甲基化提前发生，这可能是因为体细胞核中甲基化酶的存在形式和卵中的不同，且滋养层细胞发生异常的超甲基化。在小鼠克隆胚胎，核移植后囊胚期重新甲基化之前发生持续的去甲基化，滋养层细胞上出现异常的超甲基化修饰。Beaujean等[19]用同样的方法分析绵羊成纤维细胞核移植胚胎，发现2～8细胞期的核移植胚胎染色特征与供体细胞相似，显示出过高的甲基化水平，囊胚期滋养层细胞甲基化程度也较高。总之，克隆胚胎滋养层细胞的甲基化过高，明显异常。

1.2 组蛋白修饰

组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)协调催化的，一般修饰N-末端保守的赖氨酸残基部位，组蛋白乙酰化影响染色体中组蛋白和染色质之间的相互作用，利于转录因子结合和/或可调节组蛋白 N-端区与蛋白质之间的相互作用，从而促进转录[20]。研究发现，克隆牛和水牛胚胎与体外受精胚胎相比，乙酰化水平显著降低[21,22]。检测克隆猪胚胎发现，H3K9、H3K14、H4K16位点的乙酰化水平在体细胞核移入后下降，之后逐渐消失，重构胚胎激活后，乙酰化的恢复与孤雌激活胚胎相似，H3/K9、K14乙酰化发生在后/末期，H4K16乙酰化发生在原核期[23]。Wang等[24]研究发现，小鼠体细胞核移植后组蛋白H3K9和H3K14高度乙酰化，随后核质进行重构时乙酰化水平逐渐降低，而且重构胚的乙酰化整体水平比正常受精胚胎低。以上研究表明，体细胞核移植胚胎中，组蛋白乙酰化的重编程是不完全的。

组蛋白甲基化修饰主要发生在赖氨酸和精氨酸侧链，较组蛋白乙酰化更为复杂，可发生一甲基化、二甲基化和三甲基化修饰。组蛋白 H3K9的三甲基化和二甲基化与基因的沉默相关，而 H3K4甲基化引起基因转录的起始[25]。研究发现，克隆小鼠胚胎在激活后 H3K9的三甲基化和二甲基化逐渐地去甲基化，与正常受精胚胎不同，克隆胚胎中没有观察到H3K9三甲基化或二甲基化的不对称分布[24]。同样，Zhang等[26]也发现了克隆胚胎中异常的组蛋白甲基化修饰，正常囊胚的内细胞团中H3K27是三甲基化，而在克隆囊胚中却不存在这种修饰。

1.3 X染色体失活

XIST基因在 X染色体失活(X chromosome inactivation, XCI)中起重要作用，其编码非翻译的RNA ，启动X染色体的失活，XIST基因在X染色体的失活中心开始转录，并使整条染色体转录失活。在没有XIST RNA的情况下，X染色体失活也能被起始，但XIST是X染色体维持稳定沉默所必需的[27]。研究发现，在克隆小鼠囊胚中，失活的X染色体被重新激活，但在后期发育中X连锁基因异常表达，没有显示 XCI印记的正常模式[28]。Inoue等[29]研究发现，在雌性和雄性克隆胚胎中，XIST的表达水平显著高于对照组体外受精胚胎，XIST的异常表达首先出现在 4-细胞期，在囊胚期增强。流产克隆牛胎儿和死亡初生牛犊内XCI的模式发生了改变，有胎盘的牛表现出X染色体随机失活，与正常对照组和健康克隆小牛中优先失活父源X染色体相反[30]。在克隆牛囊胚中没有发现X连锁基因的异常表达，但是在后期发育中发现，死亡克隆牛的胎盘中X连锁基因是双等位基因表达，而不是母本特异性表达[31]，然而在存活的克隆牛胎盘中只有一条未失活的X染色体[30]，这表明XCI的异常模式导致了胎儿的死亡，X连锁基因的异常表达严重影响胎盘的发育。

1.4 基因组印记

基因组印记(Genomic imprinting)指控制某一表型的一对等位基因由于亲源不同而差异性表达，即机体只表达来自亲本一方的等位基因。基因组印记的产生及其控制未涉及到 DNA 序列的变化，主要依靠 DNA 差异甲基化等非基因突变因素维持。基因的正常印记对哺乳动物胚胎和胎儿的正常发育极其重要，错误的印记会引起严重的遗传疾病或致癌。在克隆动物中观察到最普遍的表型是胎儿生长异常，例如胎盘肥大、出生体重增大以及胎儿死亡，这是天然存在和印记基因的定向突变共同的作用结果，表明印记基因的异常表达可能会导致克隆动物异常发育[32]。在克隆小鼠中，没有观察到任何单一印记基因的异常表达与异常胎儿过度生长的程度之间有实质性的关联，然而，几个印记基因的累积失调对胎儿的生长具有相对的影响[33]。分析发现，植入前胚胎发育相关的印记基因——胰岛素样生长因子-2(Igf2)在克隆胚胎中的表达显著高于体外受精胚胎[34]，Igf2的过表达和Igf2r的表达下调导致小鼠胎儿和胎盘的过度生长[35]。在死亡克隆牛器官内 Igf2和H19基因表达均出现异常，而在成活的克隆牛体内，只有肌肉内的Igf2基因表达变化较大[36]。同样，在死亡克隆猪胎盘上发现Igf2和H19基因呈现异常的高甲基化水平[37]。总之，体细胞克隆过程中印记基因的异常表达是引起克隆后代发育异常和死亡的原因之一。

1.5 端粒长度

端粒是线状染色体的天然末端，通过阻止末端编码DNA序列的损耗和防止端-端染色体融合，在维持染色体 DNA的完整性方面发挥关键作用[38]。一般来说，端粒长度的一些损失发生在每个细胞分裂时，是滞后链不完全复制的结果。多莉羊是由成年上皮细胞做供体克隆所得，其端粒比同龄自然繁育羊短[39]。然而，后来的研究发现，克隆动物的端粒长度与同龄自然繁育的对照组相似，克隆动物中端粒酶的活性被重新激活到与对照组相似的水平[40]。端粒长度的调节在一定程度上与用于克隆的供体细胞类型有关，由成纤维细胞或肌细胞得到的克隆牛的端粒长度与年龄相仿的对照组相似，然而上皮细胞得到的克隆牛的端粒没有恢复到正常长度[41]。在克隆桑椹胚期端粒处于供体细胞的水平，而囊胚期端粒已经恢复到正常长度，这可能是由于早期胚胎中的端粒酶重新调整了供体基因组缩短的端粒[42]。

2 修复异常的表观遗传修饰

体细胞核移植技术效率低下的主要原因是分化的体细胞核不能被卵母细胞质完全重编程，主要表现为异常的表观遗传修饰模式。如何修复这些异常的表观遗传修饰，目前的研究大多是使用能改变表观遗传水平的小分子化合物处理重构胚胎，以及敲除或敲低相关基因来改变表观遗传修饰。

2.1 DNA甲基化抑制剂

DNA甲基化被两种 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化：DNMT1维持DNA复制期间已经建立的甲基化模式，而 DNMT3a和DNMT3b参与建立胚胎植入前的从头甲基化模式。通过应用DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)，可以抑制异常DNA甲基化的发生，修复表观遗传错误，从而提高动物克隆效率。研究证明，S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH)[43]、5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)[21,44]和RG108[45]能改变DNA甲基化修饰。

SAH是一种非核苷类化合物DNMTi，没有细胞毒性，是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代谢产物的类似物，而SAM是DNA甲基化的主要甲基供体，SAH能抑制细胞内大多数甲基转移酶的活性而并不掺入DNA。用SAH处理供体细胞成纤维细胞，发现SAH能诱导总体 DNA去甲基化，并且能提高端粒酶活性、重新激活部分失活的X染色体，所得到的克隆胚胎的发育潜力有所提高[43]。

5-aza-dC是一种核苷类似物 DNMTi，主要在DNA复制过程中掺入DNA，然后被DNA甲基转移酶识别，并与其共价结合而抑制该酶的活性，使基因组DNA发生去甲基化。Enright等[21]用0.01 µmol/L的5-aza-dC处理牛供体细胞降低了 DNA甲基化水平，同时组蛋白乙酰化水平也有所提高。5-aza-dC和TSA联合处理供体细胞和克隆胚胎，显著降低了DNA甲基化水平，提高了克隆胚胎的体外发育潜力[44]。

RG108是一种新型的色氨酸衍生物类小分子化合物DNMTi，细胞毒性小，通过与DNMT的活性位点非共价结合，阻碍其余 DNA结合，从而降低DNA甲基化水平。Xu等[45]发现RG108和Scriptaid联合使用能显著促进克隆胚胎中 NANOG基因的转录，增强植入前胚胎的发育潜力，修复体细胞克隆中H19的ICR3位点破裂的印迹DNA甲基化。

2.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)一般可以分为 5种类型：ClassⅠ(HDAC1,3和8)，ClassⅡa(HDAC4,5,7和9)，ClassⅡb(HDAC6和10)，ClassⅢ(SIRT1到7)和 ClassⅣ(HDAC11)。TSA、Scriptaid、SAHA和Oxamflatin能抑制 ClassⅠ和 ClassⅡa/b HDAC；APHA能抑制ClassⅠ和ClassⅡa/b，尤其是HDAC3和HDAC6；VPA能抑制ClassⅠ和ClassⅡa；Sirtinol只能抑制ClassⅢ HDAC[46]。

曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是第一种被发现对克隆动物制备有效的小分子化合物，TSA抑制 HDAC的作用从而使染色质处于高度乙酰化状态，这样有利于转录因子的结合，使基因处于转录激活状态。研究发现在牛[47,48]、猪[49]、兔[50]和小鼠[51]中，用HDAC抑制剂TSA处理核移植供体细胞，可以提高克隆胚胎的体外发育率。用TSA处理重构胚可以提高胚胎中H3K14、H4K12乙酰化水平，进而提高克隆效率[37]。TSA处理小鼠克隆胚胎后进行连续克隆，已经获得了25代约500只克隆小鼠，而且克隆效率并没有逐渐下降[52]。然而，TSA对克隆胚胎有毒性作用，其增强克隆胚胎的重编程的效果取决于不同种系的供体细胞对药物的敏感度[53]。

Scriptaid是一种人工合成的低毒性HDAC抑制剂，可诱导组蛋白过乙酰化，引起染色体重建，增强细胞内的转录活性和蛋白质的表达。Van Thuan等[54]利用250 nmol/L Scriptaid处理近交系小鼠克隆胚胎10 h，提高了克隆胚胎的发育能力，同时成功获得克隆后代，结束了近交品系小鼠无法克隆的历史。

Ono等[46]发现，SAHA和Oxamflatin能降低囊胚细胞的细胞凋亡水平，提高克隆小鼠发育到足月，并能显著提升核移植胚胎获得的胚胎干细胞(ntES)的建系效率，而且不会导致明显的异常。Su等[55]研究发现，Oxamflatin修改了H3K9和H3K18的乙酰化状态，提高了囊胚的质量，并且显著提高了克隆牛胚胎的体外发育。

丙戊酸(Valproic acid，VPA)是一种短链脂肪酸，一直以来被用于治疗癫痫，目前发现VPA可以诱导分化细胞的重编程。Miyoshi等[56]发现VPA能够提高小型猪克隆胚胎的体外发育以及Oct3/4基因的表达。用4 mmol/L的VPA处理24 h，能显著提高克隆牛胚胎的发育，提高了 H3K9的乙酰化水平，因而增强了细胞核重编程[57]。Kim等[58]研究发现VPA比TSA更有效地提高克隆胚胎的发育，然而，VPA对提高小鼠的克隆效率的作用甚微，但却能改善小鼠 SCNT胚胎中Oct4基因的表达以及 K3K27me3的核分布[59]。

Jin等[60]发现，一种新型的广谱 HDAC抑制剂LBH589(Panobinostat)通过改变表观遗传状态和基因表达增强核重编程以及SCNT胚胎的发育潜力，并能提高囊胚的质量。后来，他们又研究发现，1 µmol/L的CUDC-101处理24 h后能显著提高猪SCNT胚胎的发育能力，免疫荧光检测发现，H3K9的乙酰化水平高于对照组[61]。

Song等[62]研究发现，一种极性杂合化合物CBHA(m-carboxycinnamic acid bishydroxamide)能提高体细胞克隆猪胚胎的体外发育能力，提高总体的组蛋白乙酰化水平，并能修正早期发育的一些重要基因的表达。Dai等[63]先前也报道了CBHA 能提高小鼠克隆胚胎的发育能力，并能提高SCNT胚胎建立胚胎干细胞系的效率。

虽然HDAC抑制剂处理能提高克隆效率，但出生动物的存活效率并没有提高，而且HDAC抑制剂处理提高克隆效率的机制还不是很清楚。但可以推测，HDAC抑制剂可引起核心组蛋白的过乙酰化，导致染色质结构松弛，能够更容易结合转录因子，还能使供体细胞的基因组在核移植后发生 DNA去甲基化。有报道显示，用HDAC抑制剂处理能够提高组蛋白乙酰化水平、初期mRNA的产生和基因表达，与正常受精胚胎的状态相似[64]。

2.3 敲低或敲除Xist基因

对克隆囊胚基因表达谱的分析发现，与体外受精囊胚相比，克隆胚胎X染色体上许多基因的特异性表达下调[29]。X连锁基因的这种表达抑制与 Xist基因的表达升高相关联，而Xist是雌性细胞中负责失活其中一条X染色体，RNA原位杂交荧光分析卵裂球细胞核中Xist的mRNA，雄性和雌性克隆胚胎中显示一个过度的信号，这表明未失活的X染色体上Xist基因的表达异常[64]。当使用Xist敲除的供体细胞用于核移植时，卵丘细胞和支持细胞的克隆出生率分别升高了8倍和14倍[29]。同样，通过向重构卵母细胞中注射干扰RNA来敲低Xist，克隆出生率提高了大约10倍[65]。因此，敲除或敲低基因可能部分修复X连锁基因的异常表达，从而提高克隆效率。

3 展 望

体细胞核移植技术具有重要的理论研究和生产价值，可应用于治疗性克隆、濒临灭绝品种的保护、家畜的品种改良及大量繁殖、转基因动物生产、人类器官移植和建立疾病模型等研究。然而，随着诱导多能性胚胎干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)技术的出现，人们的研究重点转向了 iPS 研究。但是许多研究已经证实，iPS 技术诱导获得的 iPS细胞质量不如体细胞核移植细胞，目前仅有小鼠的iPS 细胞能完全发育为个体[66,67]，而体细胞核移植技术能够将绝大多数物种分化的体细胞重编程为多能性干细胞并发育为个体。因此，体细胞核移植技术仍是研究核重编程机制的一种重要技术手段。

表观遗传修饰是核重编程的关键，研究发现DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等能部分修复克隆胚胎异常的表观遗传修饰，能提高供体核的重编程。然而，目前使用的大多数试剂都有一定的毒副作用，因此，进一步研究效率高、毒副作用小的药物来修复表观遗传错误将是今后的主要发展方向之一。核移植后基因印记发生异常是引起克隆动物死亡的重要原因之一。目前，关于如何防止体细胞核移植后基因印记发生异常的研究较少，Hikichi等[68]利用孤雌胚胎的胚胎干细胞进行核移植，发现克隆小鼠的胎盘中印记基因Peg10的表达接近正常水平，说明不同来源的供核细胞对克隆动物的印记基因重编程有一定的影响。

新技术的应用如高通量测序技术有助于发现克隆胚胎中基因的异常表达[69]。最近，利用转录组分析发现H3K9me3是SCNT有效重编程的一个主要障碍，除去H3K9me3能显著提高克隆效率[70]。总之，随着对表观遗传重编程的深入研究，体细胞核移植技术将能更好地应用于基础研究和生产实践。

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(责任编委: 方向东)

Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer: questions and potential solutions

Huili Ji1,2, Shengsheng Lu1, Dengke Pan1

1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China;
2. Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a technology by which a highly differentiated somatic nucleus is transferred into an enucleated oocyte to generate a reconstructed embryo that subsequently develops to an offspring. However, to date, the efficiency of cloned animal is still low. The major reason is incomplete nuclear reprogramming of donor cells after nuclear transfer, which results in abnormal epigenetic modifications, including DNA methylation, histone acetylation, gene imprinting, X-chromosome inactivation, and telomere length. Most improvements have been made in somatic epigenetic reprogramming with small molecules and manipulating expression of specific genes. It is expected that SCNT will soon have broad applications in both basic research and practical production. In this review, we summarize the recent progress in epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer; in particular, we focus on strategies for rescuing the epigenetic errors occurring during SCNT.

2014-07-17;

2014-09-19

转基因生物新品种培育重大专项(编号：2014ZX0800605B)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(编号：2012AA020601)资助

纪慧丽，硕士研究生，专业方向：动物胚胎生物技术。E-mail: jihuili1989@163.com

潘登科，博士，副研究员，研究方向：动物胚胎生物技术。E-mail: pandengke2002@163.com

卢晟盛，博士，研究员，博士生导师，研究方向：动物繁殖生物技术。E-mail: sslu@gxu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.1211

时间: 2014-10-10 16:09:38

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141010.1609.001.html