piggyBac转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用

钱秋杰，车家倩，叶露鹏，钟伯雄

浙江大学动物科学学院，杭州 310058

piggyBac转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用

钱秋杰，车家倩，叶露鹏，钟伯雄

浙江大学动物科学学院，杭州 310058

piggyBac (PB)转座系统具有转座效率高、删除精确、半随机插入和携带片段较大等优点。但是作为一种转基因实验的工具，特别是在哺乳动物个体水平的转基因方面，还需要提高其转基因效率，并降低外源基因随机插入对内源基因破坏的风险。近年来的研究结果显示，PB转座系统得到了进一步改进：采用 PB转座酶与DNA特异性结合蛋白融合而构成的融合型转座酶，表现出外源片段有插入到染色体靶向位点的倾向；采用突变体筛选的方法提高了PB转座酶的活性，获得了只具有切除活性而没有插入活性的新型PB转座酶；采用PB转座系统与细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomes, BAC)载体联合使携带的外源片段长度提高到了207 kb。改进后的PB转座系统在基因组研究、基因治疗、诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)诱导及其分化方面发挥了较大的作用。文章对PB转座系统的最新研究进展和应用前景进行了综述。

piggyBac；转基因；靶向插入；转座

转座子(Transposon)又称跳跃基因，是能够在基因组上移动的DNA片段，由美国女科学家Barbara McClintock最早在 1951年提出[1]，并因此在 1983年获得诺贝尔医学及生理学奖。转座子分为DNA转座子(DNA transposon)和逆转录转座子(Retrotransposon)两大类，前者以“剪切-粘贴”(cut-paste)的方式将 DNA片段从原始基因位点转移到新的基因位点，后者是将RNA经逆转录酶反转录成DNA后再插入到新的基因位点。大量的物种基因组测序结果发现，转座子在生物进化过程中具有重要作用[2]。转座子在哺乳动物中的应用得益于由鱼类改造而来的“睡美人”转座子(Sleeping Beauty)的应用[3]，由此掀起了哺乳动物利用转座子系统的研究热潮[4～6]。但是“睡美人”转座子存在过量抑制效应和携带片段偏小(5 kb左右)等缺陷[7,8]，使其在转基因应用上受到限制。

piggyBac(PB)转座子首次在鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系TN-368中发现[9]。之后，在地中海果蝇(Ceratitis capitata)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家蚕(Bombyx mori L.)等昆虫中利用PB转座系统均取得了转基因实验的成功[10～13]。研究证明 PB转座子是一个广谱的转座系统，可以在多种生物中实现转座，其中包括酵母(Schizosaccharomyces pombe)[14,15]、真涡虫(Girardia tigrina)[16]、斑马鱼(Danio rerio)[17]、鸡[18]、牛[19,20]、猪[21,22]和水稻[23]等等。

PB转座子系统是以“剪切-粘贴”机制进行转座，即转座酶切割 PB转座子两端反向重复序列(Inverse terminator repeats, ITR)末端的TTAA序列，将转座子从原始基因座切下来，然后插入到基因组新的 TTAA位点上。最早应用于转基因实验的 PB转座系统是二元系统[24]，即采用外源基因替换 PB转座子的转座酶基因，把转座酶基因构建到另一个两端没有ITR或ITR被破坏了的表达质粒中。近年来也有实验应用一元系统，即将转座酶基因序列调整到同一质粒的PB转座子ITR序列的外侧[25]。这两种系统都能使转座片段和转座酶基因在转座后成功分离，实现转座片段插入基因组后不再转座，达到稳定遗传的目的。

PB转座系统具有多方面的优势，转座效率高[26]是 PB转座系统能够被普遍应用于转基因实验的重要原因之一。能够携带较大的外源DNA片段的能力是该系统的另一个优点，当转座片段在 14 kb以内时，转座效率不会显著下降[26,27]。PB转座系统还具有半随机(semi-random)插入的特点，即转座片段具有插入到转录起始位点上下游附近以及基因内含子区域处的TTAA位点的偏好性[28]，这使得PB系统有利于癌基因捕获和增强子捕获[29,30]。PB转座系统在转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复[31,32]，在可逆转基因的应用中具有重要作用。PB转座酶可塑性高，通过与其它功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，也可以提高外源基因转座的靶向性[33～35]。

PB转座系统在哺乳动物中同样也具有高效转座活性[26]以及其他特性，使得该系统在基因组研究、基因治疗、干细胞诱导和诱导后分化等研究领域获得了广泛的应用[33,36～44]。

1 piggyBac转座子的转座机制

PB转座子5′端和3′端各有一个不对称的末端重复结构域(Terminal repeat domain, TRD)，即都包含13 bp和19 bp的反向末端重复序列，不同的是5′端和 3′端的间隔序列分别为 3 bp和 31 bp，中间是2374 bp的内部结构域(Internal domain, ID)[45,46]。PB转座酶在转座片段末端TTAA与GGG之间的T-G进行单链切割(nick)，产生3′-OH；通过3′-OH攻击互补链的TTAA形成短暂的发卡结构(hairpin)，将转座片段从基因组上切割出来；形成发卡结构的转座片段在转座酶的作用下，再次被单切，产生 TTAA的粘性末端；最后，又以3′-OH进攻靶位点的TTAA，将目的基因插入到靶位点[47]。但是将5′和3′端TRD同时都用3′端TRD或5′端TRD代替时，并不能产生转座现象[38]，这说明转座酶在将目的片段转座到新的基因位点时需要左右臂相互配合。在供体质粒转座到受体质粒实验中，PB转座臂需要的最短 ID序列是55 bp[48]，而在供体质粒转座到受体基因组实验中，5′和3′端最短ID序列长度组合分别为311 bp和235 bp[49]或333 bp和179 bp[50]，暗示转座臂与转座酶之间的亲和力会影响PB转座系统的转座效率。

酶的功能是由结构域的结构决定的。以转座的方式来看，PB转座酶应该至少包含结合结构域(Binding domain)、催化结构域(Catalytic domain)和核定位信号(Nuclear localization signals)，可能还存在转座酶之间作用的功能域。已有研究表明，PB转座酶的核定位信号存在于转座酶C端第551～571氨基酸之间[51]。DDE重组酶具有结合镁离子的催化核心域 DDE结构域，而结构预测和突变筛选都显示PB转座酶的第 268、346、447个天冬氨酸(D)也具有类似DDE结构域的功能[47,52]，该结构域附近的其他保守氨基酸与转座酶的切割和插入功能有关，将第372位精氨酸残基与第375位赖氨酸残基突变成丙氨酸后，获得的PB转座酶只有剪切功能而丧失了插入功能[53]。通过氨基酸序列比较发现，PB转座酶存在几个氨基酸保守性比较丰富的区域[52]，这些保守区域很可能是转座酶的功能区域。用染色质免疫沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)证实PB转座酶在无转座臂的情况下，也可以结合到TTAA序列[35]。以上研究结果表明，PB转座酶具有多个功能结构域，深入地理解转座酶的这些结构域在转座功能上的作用，将有利于对PB转座酶进行改造，提高转座酶的转座活性，改善靶向转座的能力。

2 piggyBac转座子转座效率的改善

转基因效率是影响转座子系统在基因组研究、哺乳动物转基因、基因治疗等领域应用的关键因素。病毒载体因其插入效率高而广泛应用于前期的哺乳动物转基因研究中，但是因为其携带片段小、易引起癌变、外源基因易沉默等缺陷，使得该系统在应用上受到了限制。PB转座系统已经被证明能够在人HEK 293细胞和小鼠胚胎干细胞中，将外源基因转座到宿主基因组内，转基因效率较高，转基因阳性细胞数/转染前细胞总数的比率约为10-4[26]。

在小鼠胚胎干细胞中，将昆虫源PB转座酶的基因序列密码子优化成小鼠偏好的密码子，可以使转座效率提高20倍[36,38]；在人胚胎干细胞实验中，PB转座酶基因经密码子优化后，转座效率提高了10倍左右，使转基因阳性率达到5%左右，把5′端转座臂的反向末端重复序列ITR的第53位碱基T转换为C(T53C)，第136位的碱基C转换为T(C136T)，不仅能够使转座效率进一步提高 59%，而且能够使携带的转座片段长度增加到18 kb[36]，为插入大片段外源基因提供了有效方法。对密码子优化后的PB转座酶基因序列随机突变后，在酵母中筛选到18个极度活跃的 PB转座酶突变体，其中的 5个突变体(I30V/G165S、S103P、M282V、S509G/N570S 和N538K)被证实在小鼠胚胎干细胞中也具有相似或更高的转座效率，并且进一步通过突变体之间的组合找到了一个7个氨基酸发生突变、转座活性最高的突变体hyperactive piggyBac(mPB7)，其插入活性和切除活性比突变前的转座酶分别提高了9倍和17倍[54]。将昆虫源PB转座酶(iPB)突变了7个氨基酸残基的PB转座酶(iPB7)，与密码子优化的PB转座酶(mPB)相比，不仅在人肝细胞(Huh-7 cell)中的转基因效率提高了2倍，使阳性细胞数占转染前细胞总数的 0.22%左右，而且能够使外源基因在小鼠肝脏内的表达量也增加2倍[55]。在HEK293细胞中直接比较iPB、iPB7、mPB和mPB7 4个PB转座酶发现，经密码子优化后的 PB转座酶表达量比不经密码子优化的转座酶高出10倍，同时也发现PB7转座酶在低剂量情况下相对于突变前的 PB转座酶转座效率优势更加明显[56]。但是，iPB7转座酶在果蝇和埃及伊蚊中转座效果并不令人满意，虽然iPB7在果蝇细胞中转基因效率达到了 3.14×10-3，相对于原始 PB转座效率 (1.14×10-3)有所提高，但是在个体水平转基因实验中，iPB7 转座酶导致80%左右的果蝇发生了不育的现象[57]。

PB转座酶末端与某些外源肽段连接后的融合蛋白也能提高PB转座系统的转座效率。GFP、His tag、Myc tag和 HIV-TAT(HIV-1 transactivator of transcription protein)通过不同的组合与 PB转座酶融合后获得了两个重组转座酶TPLGMH和ThyPLGMH，在人 HEK293细胞的转基因实验中转座效率比Myc-tagged PB转座酶分别提高了9倍和7倍，在iPS细胞实验中也提高了 4倍；而且不同组合的重组转座酶在不同类型细胞中效率也有不同，在HEK293、CHO和C17.2细胞中最高的转座效率分别为1.1%、4.5%和 9.9%[58]。HIV-TAT蛋白含有一段能够引导整个蛋白进入细胞核内的信号肽[59,60]，该信号肽与PB转座酶融合后能够引导转座酶在细胞核聚集，从而提高了转座效率[61]。

3 piggyBac转座子靶向插入的改造

PB转座系统介导的外源片段转基因只能识别基因组中TTAA四碱基序列，具有很大的随机性，一旦转座片段插入到内源基因启动子附近或者基因内部，就可能引发基因沉默、癌基因表达等。而且PB转座系统具有插入位点偏好性，插入位点分析结果显示近一半的转座子片段插入到已注释的基因上面[28,62]，因此插入片段可能干扰机体本身的内源基因表达，影响正常的生长发育。改变PB转座系统插入位点的偏好性，甚至靶向插入到基因组特定位点，将有助于基因组研究，也是基因治疗的必要条件。GAL4(Galactose regulated upstream promoter element)能够专一性地识别UAS(Upstream activator sequences)序列，激活下游基因表达。GAL4之所以能够专一地识别UAS序列是因为GAL4上有特异识别并结合DNA序列的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)，如果利用GAL4的DBD序列与PB转座酶融合形成融合蛋白，那么转座酶就可以在DBD引导下在含 UAS序列的特异位点发生转座。GAL4-piggyBac在埃及伊蚊细胞供体质粒转座到受体质粒实验中表明，有 67%的转座片段插入到预先设定的UAS序列附近的TTAA位置[33]，在人HEK293细胞供体质粒转座到基因组实验中，有 24%的转座片段插入到UAS附近的区域[63]。但是，GAL4-piggyBac的靶向插入需要在基因组上有UAS序列，而一般情况下靶位点附近不存在UAS序列，GAL4-piggyBac融合蛋白依然不能满足自主选择插入位点的要求。

腺关联病毒(Adeno-associated virus)的Rep蛋白能特异性结合到 Rep识别序列(Rep recognition sequences, RRSs)，单纯地将该Rep蛋白与PB转座酶融合后并不能使 PB转座片段特异性插入到基因组RRSs序列附近。将RRSs序列预先插入到PB转座片段上，虽然不能达到靶向插入的目的，但是在一定程度上改变了PB转座子插入位点的偏好性[64]。

锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)和转录激活子样效应因子(Transcription activator-like effector, TALE)能够自主设计，具有特异性地识别和结合到对应序列的能力[65,66]，理论上 ZFP-piggyBac和TALE-piggyBac融合蛋白可以利用靶向作用将转座酶带到目的位点附近，实现目的基因靶向插入。将改造过的Checkpoint kinase-2 (细胞周期检查点激酶2，CHK2)-ZFP与PB转座酶融合后，和供体转座片段一起导入到人HEK293细胞内，但是转座片段并没有靶向插入到基因组上ZFP识别位点附近；进一步通过预先在基因组上插入一段CHK2-ZFP识别位点和富含TTAA的序列后，尽管ZFP-piggyBac转座酶与原始 PB转座酶转基因效率类似，但是两者在ZFP识别位点附近发生转座的细胞数占阳性细胞总数分别是43.9%和22.50%，说明ZFP-piggyBac融合蛋白确实具有一定的靶向倾向[35]。TALE相对于ZFP具有更大的自主设计的优势，可以直接在基因组上选择合适的位置设计结合位点。TALE-piggyBac融合转座酶在不经过转基因改造的人HEK293细胞基因组实验上转基因效率达到了 11%左右，但是靶向插入到 TALE识别位点附近的效率只有 0.01%～0.014%[34]。这个系统的靶向插入效率仍然很低。从以上实验结果看出在插入位点选择上，融合蛋白仍然以PB转座酶自身功能占主导，融合的DNA结合蛋白靶向作用较弱。从这一点可以看到，进一步认识和改造 PB转座酶，将 PB转座酶的催化区域与TALE等DNA特异性结合蛋白融合，从而将PB转座酶改造成在基因组任意位点都能靶向插入的新型转基因工具，是PB转座酶的一个重要的研究方向。

4 piggyBac转座子导入外源大片段基因的能力改进

基因组上存在大量的调控元件，对基因表达有重要的调控作用。但是受到转基因载体片段长度的限制，很多调控元件并不能构建到载体上。细菌人工染色体(BAC)载体能够携带300 kb大片段DNA[67]。PB转座系统具有转座大片段基因的能力，联合利用PB转座系统与BAC载体能够进行大片段基因转座。将PB转座子的左右臂序列分别构建在BAC载体的目的基因片段的两端，构建了转座片段长度分别为28 kb、70 kb和100 kb的3个BAC载体，将这些BAC载体分别与mPB转座酶或hypPB转座酶(即高效转座酶mPB7)共同导入小鼠ES细胞中，转基因实验均获得成功[27]。虽然转座效率随着转座片段的长度而有所下降，但即使是 100 kb的转座片段，经HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷酸)和FIAU(非阿尿苷)药物双筛选后，mPB转座酶和hypPB转座酶的转基因阳性率分别达到 7%和29%[27]。PB转座系统介导的 BAC载体转基因技术在人ES细胞上也获得成功，并且将转座片段扩大到了207 kb[68,69]。将含207 kb转座片段的BAC载体和PB转座酶质粒共同导入到HEK293细胞中，抗生素筛选得到 60个左右阳性细胞克隆，反向 PCR实验证明有13个细胞克隆真正含有转座片段[68]。利用原核显微注射技术共同注射PB转座酶和BAC载体到小鼠受精卵中也能获得转基因个体[70]。

5 piggyBac转座子一元转座系统的改进

供体质粒和转座酶辅助质粒构成的 PB二元转座系统在细胞上能够较好地行使转座功能，但是在单精子胞浆内注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)实验中转座效率很低。 一个自我失活(Self-inactivating)质粒可以实现PB转座系统在ICSI中的应用[71]，该 PB转座系统中转座片段序列和转座酶基因序列包含在同一个质粒中，转座酶基因的启动子构建在转座片段的ITR内，而转座酶编码基因构建在转座片段的ITR外，因此在转座片段被切除后，转座酶编码基因与其启动子被分离而失活。自我失活 PB转座系统质粒还被应用在原核显微注射实验中，相对于传统的原核显微注射，转基因效率提高了5倍[72]。但是该系统中转座片段内含有一段启动子序列，可能因为PB转座片段的随机插入，造成该启动子下游基因错误的表达，因而也存在一定的风险。另一种PB一元转座系统是将转座片段和转座酶构建在一个质粒中，并且将转座片段末端不含TTAA序列的ITR侧翼序列构建在转座酶基因两侧，该系统不仅具有与原始转座酶相似的转座效率，而且 5′端和3′端转座臂片段分别减少至35 bp和63 bp，减小了插入到基因组上的转座片段的长度[25]。

6 piggyBac转座系统的应用前景

6.1 piggyBac转座系统在功能基因筛选上的应用

传统的正向遗传学需要分子标记筛选表型相关基因，需要检测大量的分子标记和杂交后代数目，耗费大量的财力和物力。转座系统高效的转座能力，以及本身即可作为分子标记的特点，使其在寻找表型相关基因过程中能够发挥很好的作用。PB转座系统在遗传学研究中的优势在于转座效率高、插入位点分布范围广以及在转座酶存在的情况下可以进行自发地转座。在含有PB转座片段的转基因动物上，只要与含有PB转座酶基因的异性同种动物交配，就可以改变转座子插入位点[73]，能够方便地进行大规模的功能基因筛选工作。目前，PB转座系统已经广泛应用于功能基因的筛选[74～76]。

6.2 piggyBac转座系统在遗传疾病治疗上的应用

基因治疗的目标是通过靶位点基因突变(敲除或插入)，使得靶基因丧失功能或者重新恢复正常功能。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)[57]、TALE核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)[58,77]和CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 成簇规律间隔的短回文重复序列 )/Cas9(CRISPR-associated)系统[78,79]等技术的发展使得基因精确敲除成为了可能，TALEN和CRISPR/ Cas9系统介导的基因敲除治疗遗传疾病已经获得成功[80,81]，然而插入修复仍然受到插入效率的影响。PB转座系统具有高效转座、载体携带片段大等优势，为基因插入治疗提供了一种新方法。在小鼠体细胞内通过共同注射 PB转座酶载体质粒和含荧光素酶基因的转座片段，能够检测到荧光素酶基因稳定插入小鼠基因组并持续表达[82]，对小鼠静脉同时注射PB转座酶和外源基因的载体，同样可以检测到外源基因在肝脏内长期表达[37]。但是，PB转座系统仍然存在一些潜在的风险，主要是插入片段的随机性可能干扰机体正常的基因表达或沉默基因表达。而采用基因工程改造的与TALE等融合的PB转座酶，具有携带外源片段靶向插入到自主设计的基因位点的倾向，消除随机插入带来的安全隐患，但是该系统靶向效率还很低，而且存在大量的脱靶现象[33～35]，所以很显然有必要进一步开发TALE等DNA特异性结合蛋白与PB转座酶融合的新型转基因实验元件，提高其靶向效率，只有这样才能更好地应用于基因治疗。

6.3 piggyBac转座子在制备诱导多能干细胞(iPS cell)上的应用

细胞治疗已经成为第三次医学革命的主要手段，人们可以通过移植干细胞，使机体组织器官获得重新生长发育的能力。但干细胞由于道德伦理等因素的限制难以获取，为了避免道德伦理的压力，科学家发现已分化细胞可以在c-Myc、Klf4、Oct4和Sox2 4个因子的调控下获得诱导多能干细胞(iPS cell)[83]。PB转座子能够将同时携带这4个调控因子的载体插入到染色体上并进行表达，诱导生成 iPS细胞，这些细胞在细胞外形、基因表达模式和表观遗传等方面均与胚胎干细胞一致[84]。不仅如此，在干细胞分化过程中，也能够利用PB转座系统的精确删除功能将诱导iPS的因子从基因组中切除[36,40,84]，实现细胞治疗前后基因组的一致性。已有研究通过突变和筛选，获得了只具有切除功能而无插入功能的两个高效 PB 转 座 酶 突 变 体 PB7(M194V/R372A/K375A)和PB7(R372A/K375A/D450N)，使得PB转座系统介导的iPS细胞在诱导分化前能够专一性切除诱导因子序列而不发生诱导因子序列再次转座到基因组上的问题，并且仍然保持了切除后基因组精确修复的能力[66]。突变后的PB转座酶使得PB转座系统在iPS细胞获得及其分化中具有其他转基因模式所不具备的独特优势。

7 展 望

PB转座系统虽然获得了广泛的应用，但是对转座酶结构的认识仍然不清楚。通过生物信息学分析、遗传突变体筛选和晶体衍射等方式解析转座酶的功能区域，对提高PB转座系统的应用价值具有很大帮助。在基因组编辑方面可以通过改变转座酶插入识别位点(TTAA)而实现随机插入，也可以与结合蛋白(如 TALE蛋白)融合达到基因组大片段切除和靶向插入的目的。在遗传学方面，既可以利用PB转座子介导的转基因技术加快分子育种进程，也可以用于捕获功能基因。在细胞治疗方面，能够利用PB转座系统的优势将诱导因子插入到已分化的体细胞内获得iPS细胞，再通过PB转座酶的切除功能将诱导因子从 iPS细胞内切除，继而进一步诱导分化而获得目的细胞。上述这些内容可以成为今后有关PB转座系统的研究目标。

[1] McClintock B. Chromosome organization and genic expression. ColdSpring Harb Symp Quant Biol, 1951, 16: 13-47.

[2] Smit AFA. Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammalian genomes. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(6): 657-663.

[3] Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvák Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell, 1997, 91(4): 501-510.

[4] Zayed H, Izsvák Z, Walisko O, Ivics Z. Development of hyperactive Sleeping Beauty transposon vectors by mutational analysis. Mol Ther, 2004, 9(2): 292-304.

[5] Dupuy AJ, Akagi K, Largaespada DA, Copeland NG, Jenkins NA. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature, 2005, 436(7048): 221-226.

[6] Mates L, Chuah MKL, Belay E, Jerchow B, Manoj N, Acosta-Sanchez A, Grzela DP, Schmitt A, Becker K, Matrai J, Ma L, Samara-Kuko E, Gysemans C, Pryputniewicz D, Miskey C, Fletcher B, Vandendriessche T, Ivics Z, Izsvak Z. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet, 2009, 41(6): 753-761.

[7] Geurts AM, Yang Y, Clark KJ, Liu G, Cui ZB, Dupuy AJ, Bell JB, Largaespada DA, Hackett PB. Gene transfer into genomes of human cells by the Sleeping Beauty transposon system. Mol Ther, 2003, 8(1): 108-117.

[8] Hackett PB. Integrating DNA vectors for gene therapy. Mol Ther, 2007, 15(1): 10-12.

[9] Fraser MJ, Smith GE, Summers MD. Acquisition of host cell DNA sequences by baculoviruses: relationship between host DNA insertions and FP mutants of Autographa californica and Galleria mellonellanuclear polyhedrosis viruses. J Virol, 1983, 47(2): 287-300.

[10] Handler AM, Harrell RN. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Mol Biol, 1999, 8(4): 449-457.

[11] Handler AM, Mccombs SD, Fraser MJ, Saul SH. The lepidopteran transposon vector, piggyBac, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(13): 7520-7525.

[12] Lobo N, Li X, Fraser MJ Jr. Transposition of the piggyBac element in embryos of Drosophila melanogaster, Aedes aegypti and Trichoplusia ni. Mol Gen Genet, 1999, 261(4-5): 803-810.

[13] Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol, 2000, 18(1): 81-84.

[14] Li J, Zhang JM, Li X, Suo F, Zhang MJ, Hou W, Han J, Du LL. A piggyBac transposon-based mutagenesis system for the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res, 2011, 39(6): e40.

[15] Li J, Du LL. piggyBac transposon-based insertional mutagenesis for the fission yeast Schizosaccharomycespombe. Methods Mol Biol, 2014, 1163: 213-222.

[16] González-Estévez C, Momose T, Gehring WJ, Saló E. Transgenic planarian lines obtained by electroporation using transposon-derived vectors and an eye-specific GFP marker. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(24): 14046- 14051.

[17] Lobo NF, Fraser TS, Adams JA, Fraser MJJr. Interplasmid transposition demonstrates piggyBac mobility in vertebrate species. Genetica, 2006, 128(1-3): 347-357.

[18] Lu Y, Lin C, Wang X. piggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res, 2009, 37(21): e141.

[19] Kim S, Saadeldin IM, Choi WJ, Lee SJ, Lee WW, Kim BH, Han HJ, Bang DH, Lee BC, Jang G. Production of transgenic bovine cloned embryos using piggyBac transposition. J Vet Med Sci, 2011, 73(11): 1453-1457.

[20] 杜新华, 高雪, 张路培, 高会江, 李俊雅, 许尚忠. piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析. 遗传, 2013, 35(6): 771-777.

[21] Wu ZF, Xu ZQ, Zou X, Zeng F, Shi JS, Liu DW, Urschitz J, Moisyadi S, Li ZC. Pig transgenesis by piggyBac transposition in combination with somatic cell nuclear transfer. Transgenic Res, 2013, 22(6): 1107-1118.

[22] Li Z, Zeng F, Meng F, Xu Z, Zhang X, Huang X, Tang F, Gao W, Shi J, He X, Liu D, Wang C, Urschitz J, Moisyadi S, Wu Z. Generation of transgenic pigs by cytoplasmic injection of piggyBac transposase-based pmGENIE-3 plasmids. Biol Reprod, 2014, 90(5): 93.

[23] Nishizawa-Yokoi A, Endo M, Osakabe K, Saika H, Toki S. Precise marker excision system using an animal-derived piggyBac transposon in plants. Plant J, 2014, 77(3): 454-463.

[24] Fraser MJ, Cary L, Boonvisudhi K, Wang HGH. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology, 1995, 211(2): 397-407.

[25] Solodushko V, Bitko V, Fouty B. Minimal piggyBac vectors for chromatin integration. Gene Ther, 2014, 21(1): 1-9.

[26] Ding S, Wu XH, Li G, Han M, Zhuang Y, Xu T. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell, 2005, 122(3): 473-483.

[27] Li MA, Turner DJ, Ning Z, Yusa K, Liang Q, Eckert S, Rad L, Fitzgerald TW, Craig NL, Bradley A. Mobilization of giant piggyBac transposons in the mouse genome. Nucleic Acids Res, 2011, 39(22): e148.

[28] Wilson MH, Coates CJ, George AL Jr. piggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther, 2007, 15(1): 139-145.

[29] Rad R, Rad L, Wang W, Cadinanos J, Vassiliou G, Rice S, Campos LS, Yusa K, Banerjee R, Li MA, de la Rosa J, Strong A, Lu D, Ellis P, Conte N, Yang FT, Liu PT, Bradley A. piggyBac transposon mutagenesis: a tool for cancer gene discovery in mice. Science, 2010, 330(6007): 1104-1107.

[30] O'Brochta DA, Alford RT, Pilitt KL, Aluvihare CU, Harrell RA. piggyBac transposon remobilization and enhancer detection in Anopheles mosquitoes. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(39): 16339-16344.

[31] Fraser MJ, Ciszczon T, Elick T, Bauser C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol, 1996, 5(2): 141-151.

[32] Elick TA, Bauser CA, Fraser MJ. Excision of the piggy-Bac transposable element in vitro is a precise event that is enhanced by the expression of its encoded transposase. Genetica, 1996, 98(1): 33-41.

[33] Maragathavally KJ, Kaminski JM, Coates CJ. Chimeric Mos1 and piggyBac transposases result in site-directed integration. FASEB J, 2006, 20(11): 1880-1882.

[34] Owens JB, Mauro D, Stoytchev I, Bhakta MS, Kim MS, Segal DJ, Moisyadi S. Transcription activator like effector (TALE)-directed piggyBac transposition in human cells. Nucleic Acids Res, 2013, 41(19): 9197-9207.

[35] Kettlun C, Galvan DL, George AL, Kaja A, Wilson MH. Manipulating piggyBac transposon chromosomal integration site selection in human cells. Mol Ther, 2011, 19(9): 1636-1644.

[36] Lacoste A, Berenshteyn F, Brivanlou AH. An efficient and reversible transposable system for gene delivery and lineage-specific differentiation in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2009, 5(3): 332-342.

[37] Nakanishi H, Higuchi Y, Kawakami S, Yamashita F, Hashida M. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol Ther, 2010, 18(4): 707-714.

[38] Cadinanos J, Bradley A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nucleic Acids Res, 2007, 35(12): e87.

[39] Wu SCY, Meir YJJ, Coates CJ, Handler AM, Pelczar P, Moisyadi S, Kaminski JM. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to Sleeping Beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(41): 15008-150013.

[40] Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M, Kaji K, Sung HK, Nagy A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.Nature, 2009, 458(7239): 766-770.

[41] 杨欢欢, 魏峰, 刘全. piggyBac转座子应用研究进展.动物医学进展, 2010, 31(12): 91-94.

[42] 刘琳, 张美丽, 黄粤. DNA转座子在小鼠基因功能研究中的应用. 遗传, 2011, 33(5): 485-493.

[43] 马元武, 张连峰. 转座子piggyBac在哺乳动物中的应用.中国比较医学杂志, 2012, 22(1): 69-73.

[44] 杨冠恒, 曾凡一. piggyBac转座子在哺乳动物中的应用.中国畜牧兽医, 2013, 40(2): 31-35.

[45] 钟伯雄, 浩危, 庄兰芳. piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展. 中国农业科学, 2011, 44(21): 4488-4498.

[46] 谢飞, 蒋世忠, 马晴雯. piggyBac转座系统在哺乳动物及其细胞中的研究进展. 生命科学, 2011, 23(3): 255-260.

[47] Mitra R, Fain-Thornton J, Craig NL. piggyBac can bypass DNA synthesis during cut and paste transposition. EMBO J, 2008, 27(7): 1097-1109.

[48] Li X, Lobo N, Bauser CA, Fraser MJ Jr. The minimum internal and external sequence requirements for transposition of the eukaryotic transformation vector piggyBac. Mol Genet Genomics, 2001, 266(2): 190-198.

[49] Li X, Harrell RA, Handler AM, Beam T, Hennessy K, Fraser MJ Jr. piggyBac internal sequences are necessary for efficient transformation of target genomes. Insect Mol Biol, 2005, 14(1): 17-30.

[50] Zhuang LF, Wei H, Lu CD, Zhong BX. The relationship between internal domain sequences of piggyBac and its transpositionefficiency in BmN cells and Bombyx mori. Acta Biochim Biophys Sin, 2010, 42(6): 426-431.

[51] Keith JH, Fraser TS, Fraser MJ. Analysis of the piggyBac transposase reveals a functional nuclear targeting signal in the 94 c-terminal residues. Bmc Mol Biol, 2008, 9(1): 72.

[52] Keith JH, Schaeper CA, Fraser TS, Fraser MJ. Mutational analysis of highly conserved aspartate residues essential to the catalytic core of the piggyBac transposase. Bmc Mol Biol, 2008, 9(1): 73.

[53] Li XH, Burnight ER, Cooney AL, Malani N, Brady T, Sander JD, Staber J, Wheelan SJ, Joung JK, Mccray PB Jr, Bushman FD, Sinn PL, Craig NL. piggyBac transposase tools for genome engineering. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(25): E2279-E2287.

[54] Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(4): 1531-1536.

[55] Burnight ER, Staber JM, Korsakov P, Li XH, Brett BT, Scheetz TE, Craig NL, Mccray PB Jr. A hyperactive transposase promotes persistent gene transfer of a piggy-Bac DNA transposon. Mol Ther Nucleic Acids, 2012, 1(10): e50.

[56] Doherty JE, Huye LE, Yusa K, Zhou LQ, Craig NL, Wilson MH. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum Gene Ther, 2012, 23(3): 311-320.

[57] Wright JA, Smith RC, Li XH, Craig NL, Atkinson PW. IPB7 transposase behavior in Drosophila melanogaster and Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol, 2013, 43(10): 899-906.

[58] Meir YJJ, Lin A, Huang MF, Lin JR, Weirauch MT, Chou HC, Lin SJA, Wu SCY. A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations. FASEB J, 2013, 27(11): 4429-4443.

[59] Brooks H, Lebleu B, Vives E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57(4): 559-577.

[60] Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, Barsoum J. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(2): 664-668.

[61] Hong JB, Chou FJ, Ku AT, Fan HH, Lee TL, Huang YH, Yang TL, Su IC, Yu IS, Lin SW, Chien CL, Ho HN, Chen YT. A nucleolus-predominant piggyBac transposase, NP-mPB, mediates elevated transposition efficiency in mammalian cells. PLoS ONE, 2014, 9(2): e89396.

[62] Galvan DL, Nakazawa Y, Kaja A, Kettlun C, Cooper LJN, Rooney CM, Wilson MH. Genome-wide mapping of piggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother, 2009, 32(8): 837-844.

[63] Owens JB, Urschitz J, Stoytchev I, Dang NC, Stoytcheva Z, Belcaid M, Maragathavally KJ, Coates CJ, Segal DJ, Moisyadi S. Chimeric piggyBac transposases for genomic targeting in human cells. Nucleic Acids Res, 2012, 40(14): 6978-6991.

[64] Ammar I, Gogol-Doring A, Miskey C, Chen W, Cathomen T, Izsvak Z, Ivics Z. Retargeting transposon insertions by the adeno-associated virus Rep protein. Nucleic Acids Res, 2012, 40(14): 6693-6712.

[65] Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui XX, Meng XD, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Ménoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science, 2009, 325(5939): 433.

[66] Zhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat Bio-technol, 2011, 29(2): 149-153.

[67] Giraldo P, Montoliu L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res, 2001, 10(2): 83-103.

[68] Li R, Zhuang Y, Han M, Xu T, Wu X. piggyBac as a high-capacity transgenesis and gene-therapy vector in human cells and mice. Dis Model Mech, 2013, 6(3): 828-833.

[69] Rostovskaya M, Fu J, Obst M, Baer I, Weidlich S, Wang HL, Smith AJH, Anastassiadis K, Stewart AF. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res, 2012, 40(19): e150.

[70] Rostovskaya M, Naumann R, Fu J, Obst M, Mueller D, Stewart AF, Anastassiadis K. Transposon mediated BAC transgenesis via pronuclear injection of mouse zygotes. Genesis, 2013, 51(2): 135-141.

[71] Urschitz J, Kawasumi M, Owens J, Morozumi K, Yamashiro H, Stoytchev I, Marh J, Dee JA, Kawamoto K, Coates CJ, Kaminski JM, Pelczar P, Yanagimachi R, Moisyadi S. Helper-independent piggyBac plasmids for gene delivery approaches: strategies for avoiding potential genotoxic effects. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(18): 8117-8122.

[72] Marh J, Stoytcheva Z, Urschitz J, Sugawara A, Yamashiro H, Owens JB, Stoytchev I, Pelczar P, Yanagimachi R, Moisyadi S. Hyperactive self-inactivating piggyBac for transposase-enhanced pronuclear microinjection transgenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(47): 19184-19189.

[73] Bonin CP, Mann RS. A piggyBac transposon gene trap for the analysis of gene expression and function in Drosophila. Genetics, 2004, 167(4): 1801-1811.

[74] Landrette SF, Cornett JC, Ni TK, Bosenberg MW, Xu T. piggyBac transposon somatic mutagenesis with an activated reporter and tracker (PB-SMART) for genetic screens in mice. PLoS ONE, 2011, 6(10): e26650.

[75] Furushima K, Jang CW, Chen DW, Xiao NN, Overbeek PA, Behringer RR. Insertional mutagenesis by a hybrid piggyBac and Sleeping Beauty transposon in the rat. Genetics, 2012, 192(4): 1235-1248.

[76] Ni TK, Landrette SF, Bjornson RD, Bosenberg MW, Xu T. Low-copy piggyBac transposon mutagenesis in mice identifies genes driving melanoma. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(38): E3640-E3649.

[77] Bedell VM, Wang Y, Campbell JM, Poshusta TL, Starker CG, Krug RG, Tan WF, Penheiter SG, Ma AC, Leung AYH, Fahrenkrug SC, Carlson DF, Voytas DF, Clark KJ, Essner JJ, Ekker SC. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature, 2012, 491(7422): 114-118.

[78] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, Aach J, Guell M, Dicarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[79] Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013, 152(5): 1173-1183.

[80] Wu YX, Liang D, Wang YH, Bai MZ, Tang W, Bao SM, Yan ZQ, Li DS, Li JS. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell, 2013, 13(6): 659-662.

[81] Ma N, Liao BJ, Zhang H, Wang LL, Shan YL, Xue YT, Huang K, Chen SB, Zhou XX, Chen Y, Pei DQ, Pan GJ. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated gene correction in integration-free β-Thalassemia induced pluripotent stem cells. J Biol Chem, 2013, 288(48): 34671-34679.

[82] Saridey SK, Liu L, Doherty JE, Kaja A, Galvan DL, Fletcher BS, Wilson MH. piggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol Ther, 2009, 17(12): 2115-2120.

[83] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4): 663-676.

[84] Yusa K, Rad R, Takeda J, Bradley A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat Methods, 2009, 6(5): 363-369.

(责任编委: 张 博)

The improvement and application of piggyBac transposon system in mammals

Qiujie Qian, Jiaqian Che, Lupeng Ye, Boxiong Zhong

College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

The piggyBac (PB) transposon system is a useful genomic engineering tool due to its high transposition efficiency, precise excision, semi-random insertion and large cargo capacity. But, it still needs to further improve the transgenic efficiency and reduce the risk of endogenous disruption caused by the random insertion of exogenous gene, especially in transgenic experiments of individual mammals. In recent studies, the PB transposase is fused with a DNA binding protein as a chimeric protein, which can guide the transposon to pre-designed loci. Besides, PB transposases obtained by mutagenesis have dramatically enhanced transposition activity and generated a novel function which is excision competent and integration defective. Furthermore, PB transposon system can carry large exogenous DNA fragments up to 207 kb when combining with the bacterial artificial chromosome vector. So far, these modified transposon systems have been widely applied in genome studies, gene therapy and induced pluripotent stem cells (iPS cells). In this study, we review the latest studies on piggyBac transposon system and its application prospect.

piggyBac; transgene; target insertion; transposition

2014-05-27;

2014-08-29

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2012CB114601)和浙江省科技厅项目(编号：2013C32048)资助

钱秋杰，硕士研究生，专业方向：转基因家蚕丝腺生物反应器。E-mail: qianqiujie08@163.com

钟伯雄，教授，博士生导师，研究方向：家蚕分子生物学。E-mail: bxzhong@zju.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0965

时间: 2014-9-17 17:23:03

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140917.1723.002.html