瓜子金总皂苷的含量测定及其纯化工艺研究Δ

王洪兰，张亚楠，陈丽红，李 祥#（.南京中医药大学药学院，南京 0046；.第二军医大学航海与潜水医学教研室，上海 00433）

瓜子金始载于《植物名实图考》，又名小远志、地藤草、银不换，是远志科远志属植物瓜子金（Polygala japonicaHoutt.）的全草，主要分布于我国南方各省[1]。瓜子金味苦、微辛，性平，能镇咳祛痰、益智安神、活血散瘀，民间应用十分普遍且疗效显著。瓜子金中的化学成分包括三萜皂苷、黄酮、寡糖酯等，已有研究表明，瓜子金中的三萜皂苷类化合物具有显著的生理活性[2-6]。大孔吸附树脂是一类非离子型高分子化合物，具有吸附性和筛选性相结合的分离、纯化等功能，近年来在药学领域特别是天然药物精制中应用日益广泛，成为纯化中药有效成分的一种有效方法[7-10]。本研究以吸附容量、洗脱率、精制度为评价指标，考察大孔吸附树脂纯化瓜子金总皂苷的工艺条件，进一步探索纯化瓜子金总皂苷的工艺流程。

1 材料

1.1 仪器

752型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；420型三用恒温水箱（江苏国盛实验仪器厂）；RE52CS 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器设备厂）；EK-182A型电子分析天平（河南兄弟仪器设备有限公司）。

1.2 药材

瓜子金购于江苏省药材有限公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为真品，凭证标本（GZJ-PJ-2010-09）存放于南京中医药大学中药化学教研室。

1.3 试剂

瓜子金总皂苷对照品（南京中医药大学药学院中药化学实验室自制，纯度：＞95%）；D101，AB-8大孔树脂（南开大学化工厂）；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 瓜子金醇提物的制备

取瓜子金药材饮片9kg，乙醇回流提取3次，浓缩得总浸膏约1500g。

2.2 总皂苷含量的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取瓜子金总皂苷对照品50.0mg，置10ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液（每1ml中含瓜子金总皂苷对照品5mg）。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取瓜子金醇提物浸膏2.0 g，加水50ml 溶解后，用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并水层，转移至量瓶并定容至100ml，即得供试品溶液。

2.2.3 测定波长的选择 精密量取供试品溶液0.25ml和对照品溶液0.2ml，分别置10ml 具塞试管中，水浴挥干溶剂，分别加入0.2ml 的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml 高氯酸，摇匀，置于60℃水浴中加热15min，冷却后分别加入冰醋酸5ml，摇匀，放置10min，于紫外分光光度计下进行全波长扫描，随行试剂作空白。扫描结果发现，两者在580nm 波长处均有较大吸收，故确定最适检测波长为580nm。

2.2.4 标准曲线的制备 精密量取5.00mg/ml 对照品溶液0.10、0.20、0.30、0.35、0.40ml，置于5支具塞刻度试管中，随行试剂作空白，按“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定。以吸光度（y）为纵坐标，对照品进样量（x）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝0.3694x+0.1018（r＝0.9997）。结果表明，对照品进样量在0.5～2.0mg 范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密量取对照品溶液0.2ml，按“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定，在580nm波长处测定吸光度，平行测定6次。结果，RSD＝0.41%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备1份供试品溶液，精密量取0.25ml，按“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定，每隔10min测定吸光度，连续测定1h。结果，30min内的RSD＝2.37%，表明供试品溶液在30min 内稳定，故测定时间最好控制在30min以内。

2.2.7 重复性试验 按照“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，精密量取0.25ml，按“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定。结果，RSD＝1.52%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取6份样品粉末各1.0g，分别加入一定量的对照品，按照“2.2.2”项下方法制备成6份供试品溶液，精密量取0.25ml，按照“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定，计算加样回收率。结果表明，平均加样回收率为99.51%，RSD＝2.92%。

2.2.9 样品含量测定 分别精密称取3份瓜子金醇提物浸膏2.0g，按照“2.2.2”项下方法制备得3份供试品溶液，分别精密量取0.25ml，按照“2.2.3”项下方法显色并进行紫外测定，计算总皂苷含量。结果表明，瓜子金总皂苷的平均含量为20.88%，RSD＝0.89%。

2.3 瓜子金总皂苷的纯化工艺研究

2.3.1 大孔树脂的预处理、装柱与再生 将D-101、AB-8两种型号树脂均用95%乙醇浸泡24h后，湿法装柱，用5倍柱体积95%乙醇洗脱，水洗至无醇味，然后依次用5%盐酸（浸泡6h，洗脱3倍柱体积，水洗至中性）和5%氢氧化钠（浸泡6h，洗脱3倍柱体积，水洗至中性）处理，之后用95%乙醇洗脱，至乙醇洗脱液与水1∶5（V/V）混合不呈白色混浊为止，最后水洗至无醇味，取部分湿树脂备用。将剩余树脂置真空干燥器中于热力学温度（T）333K干燥至恒质量得干树脂，备用。

2.3.2 大孔树脂类型与选择 大孔吸附树脂常因类型不同，比表面积、孔径、极性差异较大，由此决定的吸附容量也有较大的差异[11-12]。本研究以吸附容量为指标，对D101、AB-8大孔吸附树脂的吸附能力进行考察，以确定富集、纯化瓜子金总皂苷的大孔吸附树脂类型。分别取上述处理得到的大孔树脂D101、AB-8各10g（干质量），以蒸馏水湿法装柱（一柱床约100ml），精密量取瓜子金醇提物溶液各10ml，分别上样于上述两种树脂柱内，预吸附2h，流速1BV/h（BV为柱床体积），过柱流出液重吸附2次，收集流份。测定流份中瓜子金总皂苷含量，比较树脂吸附量。结果表明，D101大孔吸附树脂吸附量较大，故选择D101大孔吸附树脂纯化、富集瓜子金总皂苷。D101、AB-8两种树脂吸附能力比较见表1。

表1 D101、AB-8两种树脂吸附能力比较（mg）Tab 1 Comparison of adsorption ability between D101 and AB-8（mg）

2.3.3 洗脱溶媒的确定 精密量取瓜子金醇提取物供试品溶液10ml，依次用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4BV洗脱，洗脱速度1BV/h，按1BV/份（100ml）收集流份。测定各流份中瓜子金总皂苷含量，计算洗脱率。结果表明，50%乙醇和70%乙醇洗脱部位为瓜子金总皂苷类成分的主要存在部位，且70%乙醇洗脱能力强于50%乙醇，故确定以70%乙醇作为瓜子金总皂苷类成分的洗脱溶媒。蒸馏水、30%乙醇洗脱时均有一定量的固形物存在（但是因为含量比较少，无法每份流液均测得固体物具体含量，仅目测发现）。表明蒸馏水、30%乙醇洗脱可达到除杂的目的。不同浓度乙醇洗脱试验数据见表2[洗脱率＝洗脱液中总评苷量/树脂吸附总皂苷量×100%]。

2.3.4 洗脱溶媒用量的确定 精密量取瓜子金醇提物供试品溶液10ml，依法上柱，依次用蒸馏水3BV，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4BV洗脱，洗脱速度1BV/h，以1BV/份收集流份。测定各流份中瓜子金总皂苷含量，计算洗脱率并测定固形物量。结果表明，蒸馏水洗脱用量至1BV 时，极少部分瓜子金总皂苷析出；30%乙醇洗脱用量至4BV时，在流份中未检出瓜子金总皂苷；但30%乙醇洗脱至3BV时有明显的固形物存在；而洗脱用至4BV时未发现固形物。表明30%乙醇洗脱可达到除杂质的目的，并且可以初步确定30%乙醇用量为3BV。70%乙醇洗脱用量至2BV时，瓜子金总皂苷已基本被解吸附完全；当70%乙醇用量至3BV时，流出液中未检出皂苷类成分，但为了保证洗脱完全，故将乙醇用量加至3BV。进一步确定了洗脱溶媒用量为蒸馏水3BV、30%乙醇、70%乙醇各3 BV，收集70%乙醇洗脱部位。洗脱溶媒用量的确定见表3。

表2 不同浓度乙醇洗脱试验数据Tab 2 Elution test of ethanol with different concentrations

综上所述，初步确定最佳工艺为D101大孔吸附树脂纯化瓜子金总皂苷，蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各3BV 以1BV/h速度依次洗脱，收集70%乙醇洗脱部位。

表3 洗脱溶媒用量的确定Tab 3 The amount of elution solvent

2.3.5 工艺验证试验 精密量取瓜子金醇提物溶液10ml，依法上柱，平行2份，分别用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各3BV洗脱，洗脱速度1BV/h，以1BV/份收集流份。测定各流份中瓜子金总皂苷含量、固形物量，计算洗脱率及精制度。蒸馏水仅能够洗脱出少量的总皂苷，30%乙醇洗脱部位未检出瓜子金总皂苷，但30%乙醇洗脱部位有固形物存在，表明达到了除杂、纯化的目的。70%乙醇洗脱部位总皂苷洗脱率71.53%，为其主要富集部位，且精制度达343.30%，纯化效果较好，表明所选工艺条件适宜瓜子金总皂苷的富集、纯化且重现性良好。工艺参数验证性试验结果见表4[瓜子金总皂苷精制度＝（70%乙醇洗脱液固形物中总皂苷含量/瓜子金上柱液固形物中总皂苷含量）×100%]。

表4 工艺参数验证性试验结果Tab 4 Results of technique parameter validation test

3 讨论

皂苷类成分大多无色，在近紫外区无明显吸收峰，但与某些试剂反应后能产生颜色，利用这一性质可进行比色测定[12]。本次紫外分光光度法测定瓜子金总皂苷含量发现，瓜子金总皂苷在一定范围内均显示较好的线性关系（r＝0.9997）；精密度、重复性、稳定性试验测定结果显示，其RSD 值均小于3.00%，回收率平均值为99.51%。使用紫外分光光度法测定瓜子金中总皂苷含量快速、准确。紫外分光光度法测定瓜子金总皂苷虽然反应比较灵敏、方法简单易行，但反应所产生的颜色受试剂的浓度、反应温度、反应时间等影响较大，因此试验过程中必须注意反应条件的控制。

大孔树脂吸附法是一种工艺简单、操作安全、节省成本且分离效果较好的分离方法。大孔吸附树脂是利用大孔树脂的多孔结构和树脂的选择性吸附功能，从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位的技术，它既有物理吸附作用，又因多孔状结构而能选择性筛析，所以在中药的总皂苷纯化富集工艺中有良好的发展前景。结果显示，大孔树脂70%醇洗部位总皂苷含量为71.68%，洗脱率可达71.53%。本研究得出纯化瓜子金总皂苷的工艺条件为D101大孔树脂纯化瓜子金总皂苷，蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇3BV，以1BV/h 速度依次洗脱，收集70%乙醇洗脱部位。

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