甘露聚糖肽滴鼻液的制备及其质量控制

金伟华，陈 华，张 明，蒲志强，钟 妙（.成都军区总医院药剂科，成都 60083；.泸州医学院药学系，四川泸州 646000）

甘露聚糖肽是从健康人口腔分离的α-溶血性链球菌菌株经深层培养、发酵提取而得到的一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的糖肽类物质，其具有明显增强人体免疫功能及抗肿瘤的作用。临床上用于免疫功能低下、反复呼吸道感染、白细胞减少、再生障碍性贫血及肿瘤的辅助治疗。目前，甘露聚糖肽已开发的剂型有片剂、口服液、胶囊剂、注射液，但尚无对甘露聚糖肽滴鼻液的研究。为此，我们研制了甘露聚糖肽滴鼻液。该制剂用于改善免疫功能低下以及免疫功能低下所致的反复呼吸道感染、肝炎、肝硬化的抗病毒治疗等。将甘露聚糖肽制成滴鼻液可避免肝脏首关效应，提高药物的生物利用度。甘露聚糖肽是具有免疫活性的糖肽类物质，目前关于复杂体系中单糖检测尚缺少普适的高效液相色谱（HPLC）检测方法，专用糖柱（配体交换分离）价格昂贵、易损耗且样品前处理繁琐[1]。多数制药企业及药物研发机构主要采用紫外-可见分光光度计控制甘露聚糖肽制剂的质量。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是一种具有强紫外吸收的衍生试剂，该试剂可以与还原性糖在温和条件下反应，产物无立体异构体且在紫外245 nm 波长处有强烈的吸收。因此，本研究将甘露聚糖肽水解为甘露糖，采用PMP对甘露糖进行柱前衍生，建立了甘露聚糖肽滴鼻液中甘露糖的柱前衍生化HPLC法，得到了令人满意的结果。

1 材料

1.1 仪器

1200 型HPLC 仪（美国安捷伦公司）；AL204 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，精度：0.000 1 g]；HH-S24S 数显恒温水浴锅（上海君竺仪器制造有限公司）；101-2A型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

甘露聚糖肽原料药（成都利尔药业有限公司，批号：130301，药用级）；d-甘露糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：140651-200602，供含量测定用）；PMP（成都市科龙化工试剂厂，批号：20120801，纯度：≥99.0%）；氯化钠（江苏省勤奋药业有限公司，批号：20130129，药用级）；灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：A130402L）；水为三重蒸馏水。

2 处方与制备

2.1 处方

甘露聚糖肽10.0 g，氯化钠6.0 g，加注射用水至1 000 ml。

2.2 制备

称取处方量甘露聚糖肽、氯化钠，加注射用水适量搅拌溶解后，再加注射用水至全量，搅拌均匀，加入0.1%注射用活性炭，加热煮沸15 min，趁热脱炭，无菌过滤，测定含量、pH等；合格后灌封于5 ml滴鼻液瓶中，进行澄明度、外观色泽、含量、有关物质等检查，即得甘露聚糖肽滴鼻液，设立批号为：20130415、20130419、20130422。

3 质量控制

3.1 性状

本品应为淡黄色澄明液体。

3.2 pH

量取本品50 ml，依据2010年版《中国药典》（二部）附录ⅥH项下pH测定法进行测定[2]，本品pH应为5.5～7.0。

3.3 其他

其他各项（鉴别、装量、微生物限度）检查均应符合2010年版《中国药典》（二部）附录ⅠR项下鼻用制剂要求[2]。

3.4 含量测定

3.4.1 色谱条件。色谱柱：Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（20∶80），流速：1 ml/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µl。

3.4.2 甘露糖对照品贮备液的制备。精密称取d-甘露糖对照品0.010 7 g，置于100 ml量瓶中，加水适量使溶解，用水定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为107 μg/ml的对照品贮备液。

3.4.3 对照品溶液的制备。精密量取d-甘露糖对照品贮备液20、15、10、5 ml，分别置于25 ml量瓶中，用水定容至刻度，制备成质量浓度分别为85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml的对照品溶液。

3.4.4 供试品溶液的制备。精密量取甘露聚糖肽滴鼻液2 ml，置于100 ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀；精密量取稀释液2 ml，置于顶空瓶中，加入3.0 mol/L的盐酸溶液2 ml，抽真空，封口，混匀，110 ℃水解2 h，冷却后，用3.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至中性，即得。

3.4.5 空白溶液的制备。精密量取2 ml水，置于顶空瓶中，按“3.4.4”项下方法操作制备成不含甘露聚糖肽的空白溶液。

3.4.6 系统适用性试验。取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各0.8 ml，分别加0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液与0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液[3]各0.8 ml，混匀，70 ℃水浴反应100 min。冷却后加0.3 mol/L 的盐酸溶液0.9 ml，用三氯甲烷洗涤3 次，每次2 ml，弃去三氯甲烷液，水层过滤后，定容至3 ml。分别精密吸取上清液各10µl，照“3.4.1”项下色谱条件注入色谱仪，记录色谱。结果表明，空白溶液对甘露糖的测定无干扰，待测峰分离度良好，理论板数按甘露糖峰计算不低于5 000，分离度大于1.5。HPLC色谱图见图1。

3.4.7 线性关系考察。取“3.4.2”“3.4.3”项下107、85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml 的对照品溶液，按“3.4.6”项下方法衍生处理后，进样测定，记录色谱。以对照品质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝157 25x－12.440（r＝0.999 9）。结果表明，甘露糖检测质量浓度的线性范围为21.4～107 μg/ml。

图1 高效液相色谱图A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.空白溶液；1.PMP；2.甘露糖衍生物Fig 1 HPLC chromatogramsA.control solution；B.test sample solution；C.blank solution；1.PMP；2.mannose derivative

3.4.8 精密度试验。取质量浓度为107 μg/ml 的对照品溶液，按“3.4.6”项下方法衍生处理后，进样测定，连续进样6次，记录色谱，计算峰面积的RSD＝1.87%（n＝6），表明此方法的精密度符合要求。

3.4.9 重复性试验。分别量取同一批样品6 份，按“3.4.4”“3.4.6”项下方法制备成供试品溶液后衍生处理，进样测定，记录色谱，计算峰面积的RSD＝1.31%（n＝6），表明此方法的重复性良好。

3.4.10 稳定性试验。取样品1 份，按“3.4.4”“3.4.6”项下方法制备成供试品溶液后衍生处理，分别于0、1、2、4、6、24 h 内进样测定，记录色谱，计算峰面积的RSD＝1.03%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.4.11 回收率试验。取已知含量的样品，精密加入甘露糖对照品溶液适量（42.8、64.2、85.6 μg/ml），制备成低、中、高3种质量浓度的溶液，按“3.4.4”“3.4.6”项下方法制备成供试品溶液后衍生处理，进样测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

3.4.12 样品测定。取样品3 批，按“3.4.4”“3.4.6”项下方法制备成供试品溶液后衍生处理，进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算含量，本品含甘露聚糖肽以甘露糖计算，结果见表2。

4 讨论

4.1 甘露聚糖肽的水解

由于甘露聚糖肽完全由不同链长的甘露聚糖肽分子构成，不存在单糖、双糖等小分子糖类，因此首先应水解甘露聚糖肽得到甘露糖。多糖的水解常采用盐酸、硫酸、三氟乙酸。经过试验，并权衡各种溶剂的优缺点，本研究最终采用3.0 mol/L的盐酸溶液作为水解溶媒。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

4.2 甘露糖的衍生化[4]

由于甘露糖没有紫外吸收基团，不能用于紫外检测，因此本文采用PMP化学衍生法使甘露糖带上紫外吸收基团。PMP作为衍生化试剂，可以在温和的水浴条件下与糖链进行定量反应；且HPLC法检测甘露糖衍生物，灵敏度较高，重现性好。

4.3 pH的控制

本文的主要思路是“酸水解、碱衍生”。甘露聚糖肽在酸性条件下（pH应控制在2～5）水解，水解后应调节pH至中性；甘露糖衍生时，应保证是在碱性条件下（pH 应控制在9～12）进行的。如果pH控制不好，试验很容易导致色谱图中甘露糖衍生物无检测信号。

4.4 PMP的萃取

甘露糖衍生反应结束后，在油/水两相分离时，应充分混合溶剂，由于甘露糖衍生物太少，为了检测甘露糖衍生物必须使三氯甲烷萃取过量的PMP。目前实验室现有条件，利用三氯甲烷萃取PMP 已得到较好效果，虽仍然残留部分PMP，但PMP剩余峰并不干扰目标峰的测定。

[1]王立东，张丽萍.利用木聚糖酶酶解小麦麸皮制备低聚木糖工艺参数的研究[J].黑龙江八一龙垦大学学报，2012，24（1）：61.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录17、18、44.

[3]章乐建，泮玉华，赵颖飞.高效液相色谱法测定乐清栽培的铁皮石斛不同年份甘露糖的含量[J].海峡药学，2012，24（3）：79.

[4]郝桂堂，陈尚卫，朱松，等.对氨基苯甲酸衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖及糖醛酸组成[J].色谱，2007，25（1）：75.