手性农药兽药免疫分析研究进展

曾皓鹏，雷红涛*，张炽坚，孙远明，徐振林，杨金易

（广东省食品质量安全重点实验室，广东省食品安全检测与风险控制工程技术研究中心，华南家禽疫病防控与产品安全协同创新中心，广东 广州 510642）

手性农药兽药免疫分析研究进展

曾皓鹏，雷红涛*，张炽坚，孙远明，徐振林，杨金易

（广东省食品质量安全重点实验室，广东省食品安全检测与风险控制工程技术研究中心，华南家禽疫病防控与产品安全协同创新中心，广东 广州 510642）

手性药物对映异构体在生物体内的代谢转化和毒性作用等具有立体选择性差异，因此从对映体形态水平上加强手性农药兽药的分析 研究十分必要。免疫分析法简单快捷、特异性高、灵敏度高，因而成为手性农药兽药分析研究的热点。本文介绍了近年来免疫分析法在手性农药兽药分析检测方面的应用情况，综述了抗体立体选择识别性、分子模拟技术及定量构效关系等在手性药物免疫识别机制研究中应用，并展望手性免疫分析技术的研究和应用发展趋势。

手性；农药；兽药；免疫分析；识别机制

20世纪70年代以来，随着立体化学的发展，农药兽药的研究和开发逐渐深入到了分子立体异构领域，单一手性体农药兽药相继出现在市场上。目前世界上使用的商用农药中有25%具有手性中心[1]，而我国由于大量使用拟除虫菊酯（pyrethroids）、有机磷（organophosphorus）及异丙甲草胺（metolachlor）等具有手性结构的农药，因而这一比例估计将超过40%[2]。如就农药总量而言，则已有超 过60%的农药为手性农药。

过去在研究手性农药和兽药的药效、环境污染行为以及生态效应时，人们简单地将其外消旋体当作纯的单一化合物看待，即便在发达国家，其环境管理的相关法律法规也是如此。随着农药兽药毒理学在对映体形态水平上的深入研究，人们发现虽然手性药物的对映异构体具有相同的理化性质，但由于蛋白质、酶、核酸、磷脂质、糖类等生物大分子具有高度专一的立体选择性，因而手性药物对映异构体与生物体内的酶、受体、离子通道等作用靶点结合时会表现出不同的立体选择性。这表明手性药物对映异构体在生命体内的吸收、代谢、药理作用及生物效应（如致畸、致癌、致突变、内分泌干扰活性）[3]等方面可能会表现出较大的差异。例如除草剂异丙甲草胺，其S-构型具有除草活性，而R-构型却可致突变；三唑类杀菌剂（paclobutrazol）（2S，3S）-构型具有高杀菌、低植物生长抑制作用，而（2R，3R）-构型却有相反的作用；杀虫剂溴氰菊酯有3 个手性中心8 个异构体，活性最高的异构体（3R，1R，S）的活性是活性最差异构体（3S，1S，R）的70多倍；氧氟沙星S-构型的抗菌活力是R-构型的8～12 倍，且R-构型的氧氟沙星毒性较大。如今，手性药物对映异构体的安全性评价日益受到重视，美国、日本以及欧洲一些国家均已要求在农药新品种登记或再登记中，凡涉及手性化合物时必须提供其对映异构体的生物试验报告及对映体分离技术资料，一些欧洲国家甚至已经开始禁用外消旋体[4]。

为了准确地测定手性农药兽药的手性纯度，在对映体形态水平上科学地评价其对人类健康和生态系统的安全性和风险性，研究和发展快速、准确、灵敏、简便的手性药物对映体分析方法十分重要。目前，国内外用于手性药物分析研究的方法主要有以高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-10]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[11-15]、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）[16-17]和超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography，SFC）[18]为主的色谱分析法和免疫分析法（immunoassays）等。虽然色谱分析法在手性农药兽药的拆分上应用比较广泛，但该方法对选用的手性选择剂要求比较高， 需要考虑固定相、流动相、柱温、流速、测试物等因素，且操作过程费时费力、需要投入大量经费。因此，为了实现快速批量分析手性农药和兽药，人们研究建立了免疫分析法，并借助计算机技术分析实验结果，从三维空间上研究手性药物分子的空间构型和性能，以了解生命过程中手性药物分子构型与受体间的关系和生化反应过程中手性药物分子构型与立体选择性之间的关系。本文介绍了目前免疫分析法在手性农药兽药检测分析上的应用情况，同时对手性抗体识别性、分子模拟技术及定量构效关系等在手性药物免疫识别机制研究的应用进行综述，并对手性免疫分析未来的研究和应用发展趋势进行了展望。

1 免疫分析法在手性农药兽药分析中的应用

免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术，把抗体作为生物化学检测器对检测样品中微量的化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析，具有特异性好、灵敏度高、方便快捷、前处理简单、检测成本低、安全可靠等优点。20世纪90年代以来，它在粮食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中农药兽药的残留分析上得到迅速发展和应用，美国化学学会（American Chemical Society，ACS）已将免疫分析与气相色谱、液相色谱共同列为农药、兽药、渔药残留分析的三大支柱技术[19]。

手性药物对映体的分离和分析需要合适的载体，而高立体选择特异性的抗体几乎能用于识别包括手性药物在内的所有化合物[20]。早在20世纪初，Landsteiner研究利用D-酒石酸抗体来分辨酒石酸的对映异构体，证明抗体能够分辨手性化合物的立体异构体，为抗体的立体选择性行为奠定了研究基础[21]。近年来，科研人员开始利用抗体这一特性来分析研究手性化合物。他们把抗体作为色谱手性选择剂分离和纯化对映异构体，现已有多种手性药物如布诺芬、芬罗唑、二芳烷基三唑等成功通过免疫亲和色谱法进行拆分[22-24]。此外，利用抗体对手性药物的立体选择性，多种高灵敏度、高特异性的对映体免疫检测分析法也被逐渐建立起来，包括放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）、荧光免疫微阵列法（fluorescence microarray）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和免疫传感器（immunosensor）等。RIA已经被用于各种手性药物和代谢物、类固醇、植物生长调节剂的立体选择性检测，但由于用来标记的放射性元素价格昂贵，且用量受到法律严格限制，因此近年来该方法在手性药物分析上的文献报道相对较少。相比之下，操作安全简便的ELISA是个很好的代替，而且灵敏度高、特异性和精密度也很好，价格也比较便宜，近几年来国内外在手性药物ELISA方法建立的研究较为活跃，并以此来研究手性药物对映体与抗体或蛋白结合能力的文献报道也不断增多。表1列举了近年来各种免疫分析方法在手性药物分析研究的应用情况。

2 手性免疫识别机制研究进展

虽然近年来免疫分析方法在手性药物的分析研究中已取得较好的发展，但是其应用普及程度仍不如色谱分析法。这是因为免疫分析方法中抗体是通过手性半抗原药物与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联后周期性免疫动物来获取的，抗体的立体结构及特性等具有不可预测性。在缺乏理论指导下，抗体制备的结果往往不能如愿[37-38]。如果能揭示和阐明手性抗体与手性药物之间的立体选择性识别机制，即可利用该机制改善手性半抗原的设计或从分子水平上改造抗体的性能[39]，为免疫分析法在手性药物的分析研究应用提供重要的理论指导。因此，近年来手性抗体与对映异构体之间的相互作用、识别机制的研究已成为了手性药物免疫分析研究的新热点。

表1 免疫分析法在手性药物分析中的应用Table1 Applications of immunoassay for detecting chiral drugs

2.1 抗体交叉反应及其立体选择识别的研究

通过免疫分析法获取抗体与手性半抗原药物及其类似物之间的交叉反应数据，结合化合物的化学结构进行直观分析，是目前研究抗体与手性半抗原识别机制最简单也是最常用的方法。

Shan Guomin等[33]在酯键水解3-[4-（3-甲酰苯氧基）苯基]丙酸苄酯后与S-氰戊菊酸连接制得半抗原，分别与牛血清白蛋白偶联制得包被抗原及与血蓝蛋白（limpet hemocyanin，LPH）偶联制得免疫半抗原，免疫所得多克隆抗体与（1S，2R）、（1R，2S）、（1R，2R）、（1S，2RS）、（1R，2RS）、（1RS，2RS）等不同构型的氰戊菊酯进行交叉反应，交叉反应率分别为（93±7）%、（14±4）%、（1.8±0.8）%、（97±3）%、（14±2）%、（60±9）%。结果表明菊酯的酸部分比醇酮部分更能决定抗体的立体选择性，并进一步推测半抗原离蛋白越远越能决定抗体立体选择性。

Cao Mengmeng等[40]使用S-生物丙烯菊酯单一异构体（1R，3R，4’S）合成半抗原，在恰当的位点引入合适的间隔壁并保持菊酸和醇酮手性位点的构型（图1），获得的抗体对ES-生物丙烯菊酯（1R，3R，4’RS）、右旋丙烯菊酯（1R，3RS，4’RS）、丙烯菊酯（1RS，3RS，4’RS）有较大的交叉反应率，分别为59.3%、42.3%、21.7%，表明抗体对4’S构型的对映体比4’R构型的对映体有更好的亲和性，但却很难识别1S和3S位点，这证明菊酯的手性位点都具有立体选择性，并且菊酯的酸部分比丙烯醇酮部分更能决定抗体的立体选择性，而离蛋白越远的手性位点对抗体立体选择性作用越强。

图1 生物丙烯菊酯半抗原的合成设计[[4400]]Fig. 1 Synthetic route to the hapten[40]

图2 莱克多巴胺与去羟基莱克多巴胺结构示意图[[4411]]Fig.2 Structures of ractopamine and des-hydroxy ractopamine[41]

Shelver等[41]用消旋体莱克多巴胺制备出相应的单克隆抗体，研究发现该抗体与对映体（1R，3R）的亲和性最强，其交叉反应率高达489%，而对映体（1R，3S）交叉反应率只有0.9%。若改变C1的构型为S型，其对映体（1S，3R）与抗体的亲和力则无太大变化。这表明抗体与该手性半抗原结合时，其手性识别位点主要为C3。此外，在将C1上的β-羟基去掉后（图2），把只剩下C3一个手性碳原子的对映体与抗体反应，发现当C3的构型为R型时C1上β-羟基的存在与否对于抗体的亲和力无太大影响，而当C3为S型时C1上β-羟基的存在则会进一步降低手性半抗原与抗体的亲和力。

Pierre等[42]利用异构体与抗体的交叉反应数据研究了手性碳与偶联蛋白的距离对手性识别的影响。两种间隔臂不同的半抗原（抗焦虑药S-20499）分别与蛋白偶联并免疫兔子，得到了两种手性多抗（S1，S2）。研究发现，这两种抗体都能立体选择性识别S-20499，与另一个对映体的交叉反应＜0.1%。而S2与药物各种类似物的交叉反应均比S1要低。这说明对于抗焦虑药S-20499，偶联蛋白与手性中心的距离对所产生的抗体的立体选择性无影响，但用间隔臂长的免疫原生产抗体既能保持抗体有足够强的对映体选择性，又能提高抗体的结构特异性。

以上文献说明，结合手性药物的化学结构分析其交叉反应数据能在表观上推测手性抗体与手性半抗原识别的重要位点，以及哪些官能团可能对其立体选择性造成影响。然而，决定手性抗体立体选择性的因素有很多，如手性碳原子的位置、连接手性碳原子的基团、抗原结合位点的疏水性、抗原抗体结合的亲和力等[43]，用该方法所能获得的信息有限，而且其推测的规律具有不确定性，在解释复杂的手性免疫识别机制上存在一定的局限性。

2.2 分子模拟技术在手性免疫识别机制的应用研究

为进一步科学阐释手性抗体与对映体的立体选择性机制，近年来有研究者开始尝试利用分子模拟等计算机技术来辅助建立小分子有害物的免疫检测分析方法，取得了一定的进展。分子模拟和分子对接是一种有效的并能深层次分析手性抗体与手性半抗原作用机制的研究手段。它利用基因工程方法获取手性抗体的基因序列，然后利用软件模拟出抗体结合位点的三维结构，通过与手性半抗原模拟结合来得知两者的空间结构变化以及相互作用类型等信息。这种模拟方法可以提供许多实验获得不到的信息，如原子电荷、轨道参数、静电势等，可在免疫分析中用于辅助设计半抗原、解释交叉反应以及抗体识别机制等，在小分子免疫检测分析技术研究中具有很好的应用前景[44]。

Ranieri等[45]利用单克隆抗体提供的基因信息，在SWISS-MODEL软件上构建了抗右旋氨基酸抗体结合位点的三维结构（图3），并与D-芳香族氨基酸进行分子对接。结果发现，半抗原的大部分结构牢牢陷入了抗体结合位点的大空腔中，并与结合位点上的氨基酸残基形成了4个氢键。同时结合过程中还包括了多个疏水相互作用，半抗原的侧链与抗体结合位点上的色氨酸、酪氨酸残基形成了π-π叠合。相反，与L-芳香族氨基酸进行分子对接时，由于空间位阻的关系半抗原无法进入结合位点的空腔中。这说明，手性抗体与D-芳香族氨基酸的选择性结合是空间结构吻合与化学键形成的共同结果。

图3 用SWISS-MODEL模拟的抗L-芳香族氨基酸抗体表面轮廓及与抗原结合的位点[[4455]]Fig.3 Surface contour representation of anti-L-AA using SWISS-MODEL[45]

Geva等[46]利用左旋亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸三联体晶体制备了具有不同特异性的两株单克隆抗体。48E抗体能特异识别三联体左旋晶面，而不识别其右旋晶面或者其他非手性晶面，602E抗体则能识别三联体的所有晶面。在构建这两种抗体结合位点的三维结构并与三联体的不同晶面进行分子对接时发现，48E抗体结合位点上主要为亲水性的氨基酸残基，而没有带电荷的氨基酸残基。其CDRs区的L1和H3环形成了一个“脊”，并与三联体的L-晶面上的“槽”相吻合，在其中一个结合模型中形成了9 个氢键和12 个疏水相互作用。而与三联体D-晶面对接时，虽然抗体与晶面在空间上的吻合度与L-晶面相当，但形成的氢键和疏水相互作用力却少了很多（图4）。相反，采用602E抗体与所有晶面对接时其在空间结构上都不能互相吻合，也没有形成化学键，但其结合位点上大量的带电荷的氨基酸残基与每个晶面结合时都能产生静电作用，导致了该抗体能识别三联体的所有晶面。由此推断，抗体的特异性是通过空间互补与化学相互作用实现的，后者是抗体具有手性识别能力的基础。而具有广谱特异性的抗体与半抗原结合时的作用力主要为静电作用，且该作用力比空间位阻影响更大。

图4 48E抗体（a、b）和602E抗体（c）分别与左旋亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸三联体晶体对接模型[[4466]]Fig.4 Docking models of antibody 48E (a, b) and antibody 602E (c) on the face of the (L)Leu-(L)Leu-(L)Tyr crystal[46]

Nevanen等[47]构建了抗左旋芬罗唑抗体的三维模型，分别与芬罗唑对映体进行对接实验。结果发现抗体上有多个氨基酸残基与抗体的结合空腔大小、空间结构稳定性、疏水相互作用、氢键作用以及π-π叠合的形成有关。将这些与抗体亲和性有关的氨基酸残基分别进行定点突变，其中有4 种突变体既保持原有的对映体选择性，又在一定程度上降低了对左旋芬罗唑的亲和性，可在亲和色谱中循环使用。这些成功被改造的抗体片段其被突变的氨基酸残基本身与左右旋芬罗唑的氟苯基都能形成相互作用，故改变这些氨基酸不会对抗体的立体选择性造成太大影响。

2.3 定量构效关系在手性免疫分析中的研究应用

定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是在构效关系（structure-activity relationship，SAR）研究的基础上发展起来的，通过对现有的活性分子进行分析，以化合物的结构和理化参数为自变量，生物活性为因变量，用数理统计方法建立起化合物的化学结构与生物活性之间的 定量关系[48]。QSAR旨在揭示化合物生物活性如何随着化合物的结构及理化参数的变化而改变，从而推测其可能的作用机理，其建立的数学模型还可以对化合物的分子结构与化学或生物活性的关系给予定量描述，从而达到预测尚未研究的化学行为的目的。

在免疫分析中，第一个重要的环节就是设计半抗原。通常半抗原化学结构的一点小改变，都可能会引起其空间结构较大的变化而导致抗体制备的失败。而在手性药物的免疫分析中，为了获得高特异选择性的抗体，半抗原的设计就显得更重要和要求更高。然而由于对抗原抗体作用机理的了解不多，目前半抗原的设计大多仍处于对平面化学结构的相似性，通过大量重复实验来验证半抗原的设计是否合理，这耗费了很多宝贵的时间和精力。为了克服传统方法带来的大量盲目合成和筛选的弊端，更加有效地制备高特异选择性抗体和建立免疫学方法，人们开始借助QSAR来模拟其空间结构和描述其物理化学特征（如静电势），促进免疫分析技术的发展。

2.3.1 定量构效关系在半抗原设计上的应用研究

近年来，国内外开始有科研人员应用QSAR进行半抗原辅助设计。如Pinacho等[49]借助模型设计了氟喹诺酮类抗生素的半抗原，以此制备的抗体能够灵敏地识别10种氟喹诺酮药物。为了得到高特异性的抗体，陈秀金[50]在设计拟除虫菊酯半抗原时利用计算机软件Discovery Studio 2.5和Gaussian 04对半抗原和菊酯的结构进行空间模拟和原子电荷计算，选择与菊酯空间结构和电荷分布最匹配的半抗原为免疫半抗原，选择二者差异较大的为包被半抗原。通过测定氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯共14 个单体的抑制曲线来研究菊酯单克隆抗体的立体选择性。结果表明，抗体只识别氯氰菊酯的单体CP6（1S，3S，αS）和单体CP7（1S，3S，αR）、甲氰的单体FP2（αS型）以及氰戊菊酯的单体FV1（αS S），而且CP7比CP6灵敏度要高很多。

2.3.2 定量构效关系在抗原抗体相互作用上的研究

近年来，QSAR分析技术还被用于解释抗体与不同药物（包括手性药物）的识别能力。如王战辉等[51]利用氟诺喹酮类抗生素抗体的活性值和分析物结构参数建立了3D-QSAR模型，应用比较分子立场分析（comparative molecular field analysis，CoMFA）研究解释了抗体的交叉反应。

陈秀金[50]基于菊酯单克隆抗体对氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯14 个对映体单体交叉反应的结果，构建了3 种QSAR即二维定量构效（2D-QSAR）模型、全息定量构效（HQSAR）模型和虚拟定量构效（topomer QSAR）模型。由2D-QSAR模型得出，抗体活性和菊酯的疏水性大小、氢受体的个数有关，而且菊酯的疏水性越小，抗体识别能力会越好。HQSAR模型从亚结构水平分析发现在免疫反应中暴露比较少的片断，对抗体活性也有一定的影响。2D-QSAR模型和HQSAR模型的交叉验证系数q2=0.92，表明这2 个模型具有很好的预测能力。此外以氰戊菊酯为例将各化合物切成3 段R1，R2和中间共同部分，通过构建topomer QSAR模型计算分子关键片段（R2）的空间场和静电场等高势（图5），来解释拟除虫菊酯抗体与对映体单体的交叉反应。

图5 片段R2的空间场(a)和静电场(b)的等高势图[[5500]]Fig.5 Steric contour map (a) and electrostatic contour map (b) of fragment R2[50]

此外，通过建立QSAR模型还可对分子结构参数和抗体活性之间的相关性进行分析，探索抗原抗体的作用机理。Yuan Meng等[52]利用苯基脲类除草剂交叉反应结果建立2D-QSAR和HQSAR模型，研究表明对抗体识别影响最大的结构参数为苯基脲类除草剂的疏水性；尽管半抗原和载体蛋白之间的连接臂在免疫反应中暴露较少，但通过亚结构水平分析发现这些结构对于抗原抗体之间的相互作用也起着重要的作用；此外，模型也显示苯基脲类除草剂分子的前沿未占轨道能量参数的也会影响免疫反应。

3 结 语

随着科学技术的不断发展，人们对手性农药兽 药不同对映体生物活性研究等方面不断深入，规范手性农药兽药使用的环保法规将变得日益严格，各种手性农药兽药残留分析检测技术将得到广泛的应用和发展，并将向系统化、规范化、小型化和自动化方向发展。 而高立体选择性、高特异性的抗体除了被广泛运用到RIA、ELISA等免疫分析方法中去外，近年来也开始被制成手性抗体柱 和手性光学传感器等运用到手性亲和色谱法和表面等离子体共振光谱（surface plasmon resonance，SPR）[53]等中。

虽然手性抗体已被较为广泛地应用到手性药物的分离和分析检测中，但目前国内外对抗体与手性对映体识别机制的研究无论是方法还是数据结论都比较有限。近年来，人们在手性药物免疫分析研究的基础上开始借助计算机软件技术和多种现代仪器分析手段如X射线晶体衍射（X-ray crystallography）[54]、荧光光谱法（fluorescence spectr um，FS）[55]等研究抗体与手性对映体间的相互作用及其识别机制。相信随着免疫分析方法与其他各种分析方法的合理搭配运用，从多方面多角度来研究手性抗体和对映体药物反应过程，将会有更多、更详细、更准确的信息可用来完善免疫学原理以及解释手性抗体与手性药物的识别机制。

[1] WILLIAMS A. Opportunities for chiral agrochemicals[J]. Pesticide Science, 1996, 46(1): 3-9.

[2] YING Zhou, LING Li, KUNDE L, et al. Enantiomer separation of triazole f ungicides by high-performance liquid chromatography[J]. Chirality, 2009, 21(4): 421-427.

[3] 唐梦龄, 王丹, 傅柳松, 等. 手性农药毒性机制的对映体选择性[J].农药学学报, 2011, 13(4): 335-340.

[4] 周青燕, 章程, 柴如山, 等. 手性除草剂研究进展[J]. 农药学学报, 201 0, 12(2): 109-118.

[5] 商永严, 孙楠, 胡宝祥, 等. 吡氟 禾草灵的高效液相色谱法拆分与测定[J]. 理化检验: 化学分册, 2008, 44(4): 319-320.

[6] 黄小龙, 张炽坚, 孙远明, 等. 高效液相色谱法拆分异丙草胺对映体[J].武汉大学 学报: 理学版, 2014, 60(1): 62-66.

[7] 田芹, 任丽萍, 吕春光, 等. 反相色谱条件下三唑类手性农药对映异构体的拆分[J]. 分析化学, 2010, 38(5): 688-692.

[8] HOU S C, ZHOU Z Q, QIAO Z, et al. Separation of the enantiomers of tebuconazole and its potential impurities by high-performance liquid chromatography with a cellulose derivative-based chiral stationary phase[J]. Chromatographia, 2003, 57(3/4): 177-180.

[9] 孙小杰, 邵兵, 董慧茹, 等. 液相色谱测定水样中的氧氟沙星手性对映体[J]. 北京化工大学学报: 自然科学版, 2008, 35(1): 20-23.

[10] MSKHILADZE A, KARCHKHADZE M, DADIANIDZE A, et al. Enantioseparation of chiral antimycotic drugs by HPLC with polysaccharide-based chiral columns and polar organic mobile phases with emphasis on enantiomer elution order[J]. Chromatographia, 2013, 76(21/22): 1449-1458.

[11] 袁合 金, 张安平. 手性气相色谱同时测定土壤中5种有机氯农药对映体分数[J]. 分析化学, 2009, 37(4): 630-631.

[12] 戴守辉, 赵桦林, 王敏, 等. 手性气相色谱质谱法测定莲藕及底泥中的多氯联苯对映体[J]. 分析化学, 2012, 40(11): 1758-176 3.

[13] 吴桂平, 许寒, 徐大振, 等. 手性气相色谱法测定2-氯丙酸乙酯的含量及光学纯度[J]. 农药, 2012, 51(12): 884-889.

[14] HUANG Ke, ARMSTRONG D W, FORRO E, et al. Separation of enantiomers and control of elution order of beta-lactams by GC using cyclodextrin-based chiral stationary phases[J]. Chromatographia, 2009, 69(3/4): 331-337.

[15] 谢建荣. 成品杀虫剂氯氟氰菊醋手性异构体[J]. 福建分析测试, 1998, 7(4): 941-946.

[16] 韦寿莲, 邓光辉. 手性药物的毛细管电泳拆分[J]. 分析测试学报, 2007, 26(6): 907-910.

[17] 夏陈, 陈志涛, 夏之宁. 基于非手性离子液体的毛细管电泳法拆分3种手性药物[J]. 色谱, 2008, 26(6): 677-681.

[18] 马斌斌. 手性苯氧羧酸类除草剂在超临界流体色谱中的对映体分离研究[D]. 杭州: 浙江工业大学, 2012.

[19] 杨依军, 王勇, 杨秀荣, 等. 免疫分析法在农药残留分析中的应用[J].华北农学报, 2001, 16(4): 119-124.

[20] HOFSTETTER H, HOFSTETTER O. Antibodies as tailor-made chiral selectors for detection and separation of stereoisomers[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2005, 24(10): 869-879.

[21] 王保玲. 旋光异构氧氟沙星抗体制备及其识别性能差异研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2010.

[22] IKEGAWA S, ISRIYANTHI N, NAGATA M, et al. The enantioselective immunoaffinity extraction of an optically active ibuprofen-modified peptide fragment[J]. Analytical Biochemistry, 2001, 296(1): 63-72.

[23] VUOLANTO A, LEISOLA M, JOKELA J. Enantioselective affinity chromatography of a chiral drug by crystalline and carrier-bound antibody Fab fragment[J]. Biotechnology Progress, 2004, 20(3): 771-776.

[24] NEVANEN T K, SODERHOLM L, KUKKONEN K, et al. Efficient enantioselective separation of drug enantiomers by immobilised antibody fragments[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 925(1/2): 89-97.

[25] MANNAERT E, TYTGAT J, DAENENS P. Development of a stereospecific radioimmunoassay for the analysis of zopiclone and metabolites in urine[J]. Clinica Chimica Acta, 1996, 253(1/2): 103-115.

[26] GOT P, RAIMBAUD E, BUSSEY C, et al. Production and characterization of 22 monoclonal antibodies directed against S 20499, a new potent 5-HT1A chiral agonist: influence of the hapten structure on specificity and stereorecognition[J]. Pharmaceutical Reserch, 1999, 16(5): 725-735.

[27] 沈鸿, 肖红, 李瑞. 双抗体夹心ELISA法定量检测左旋多巴[J]. 实用药物与临床, 2010,13(1): 32-35.

[28] 王伟华, 雷红涛, 孙远明. 消旋氧氟沙星抗体制备及其手性识别特性研究[J]. 食品工业科技, 2011, 32(9): 198-203.

[29] 张斌. S,S-氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附测定方法研究[D]. 南京:南京农业大学, 2011.

[30] 曹猛猛. S-生物丙烯菊酯免疫分析方法研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2012.

[31] CHEN Sigeng, ZHANG Jun, LUMLEY L, et al. Immunodetection of serum albumin adducts as biomarkers for organophosphorus exposure[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2013, 344(2): 531-541.

[32] ZELEKE T K, ZELEKE J M, HOFSTETTER H, et al. Stereoselective antibodies to free alpha-hydroxy acids[J]. Journal of Molecular Recognition, 2005, 18(4): 334-340.

[33] SHAN Guomin, DONALD W, INGRID W, et al. Development of an immunoassay for the pyrethroid insecticide esfenvalerate[J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(5): 2145-2155.

[34] CHIKHI-CHORFI N, GALONS H, PHAM-HUY C, et al. Selective antibodies to methadone enantiomers: synthesis of (R)- and (R,S)-methadone conjugates and determination by an immunoenzymatic method in human serum[J]. Chirality, 2001, 13(4): 187-192.

[35] KASSA T, UNDESSER L P, HOFSTETTER H, et al. Antibody-based multiplex analysis of structurally closely related chiral molecules[J]. Analyst, 2011, 136(6): 1113-1115.

[36] SILVAIEH H, WINTERSTEIGER R, SCHMID M G, et al. Enantioselective sequential-injection chemiluminescence immunoassays for 3,3’,5-triiodo thyronine (T3) and thyroxine (T4)[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 463(1): 5-14.

[37] CAO Limin, KONG Dexin, SUI Jianxin, et al. Broad-specific antibodies for a generic immunoassay of quinolone: development of a molecular model for selection of haptens based on molecular fieldoverlapping[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(9): 3246-3251.

[38] YUAN Meng, NA Yu, LI Lingling, et al. Computer-aider molecular modeling study on antibody recognition of small molecules: an immunoassay for triazine herbicides[J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60: 10486-10493.

[39] XU Zhenlin, XIE Guimian, LI Yongxiang, et al. Production and characterization of a broad-specificity polyclonal antibody for O,O-diethyl organophosphorus pesticides and a quantitative structureactivity relationship study of antibody recognition[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 647(1): 90-96.

[40] CAO Mengmeng, LI Ming, YAN Xu, et al. Stereoselectivity of an enzyme-linked, immunosorbent assay for S-bioallethrin[J]. Analytical Methods, 2012, 4(2): 534-538.

[41] SHELVER W L, SMITH D J, BERRY E S. Production and characterization of a monoclonal antibody against the β-adrenergic agonist ractopamine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(9): 4020-4026.

[42] PIERRE A, GUILLAUMET G, BOURSIER-NEYRET C, et al. Production and characterization of polyclonal anti-S 20499 antibodies: influence of the hapten structure on stereospecificity[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1997, 86(6): 654-659.

[43] PIERRE A, JEAN M. Stereoselectivity of antibodies for the bioanalysis of chiral[J]. Pharmaceutical Research, 1997, 14(11): 1516-1523.

[44] XU Zhenlin, SHEN Yudong, BEIER R C, et al. Application of computer-assisted modeling for immunoassay of low molecular weight food contamin ants: a review[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 647(2): 125-136.

[45] RANIERI D I, HOFSTETTER H, HOFSTETTER O. Computational structural analysis of an anti-L-amino acid antibody and inversion of its stereoselectivity[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(10): 1686-1695.

[46] GEVA M, EISENSTEIN M, ADDADI L. Antibody recognition of chiral surfaces. Structural models of antibody complexes with leucineleucine-tyrosine crystal surfaces[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, 55(4): 862-873.

[47] NEVANEN T K, HELLMAN M L, MUNCK N, et al. Model-based mutagenesis to improve the enantioselective fractionation properties of an antibody[J]. Protein Engineering, 2003, 16(12): 1089-1097.

[48] 胡荣静. HIV-1逆转录酶及其抑制剂的分子模拟研究[D]. 兰州: 兰州大学, 2009.

[49] PINACHO D G, S˘NCHEZ-BAEZA F, MARCO M P. Molecular modeling assisted hapten design to produce broad selectivity antibodies for fluoroquinolone antibiotics[J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(10): 4527-4534.

[50] 陈秀金. 拟除虫菊酯类农药免疫快速检测方法及其定量构效模型的建立[D]. 无锡: 江南大学, 2013.

[51] 王站辉, 沈建忠, 张素霞. 喹诺酮类药物抗体制备研究进展及策略分析[J]. 中国农业科学, 2008, 41(10): 3311-3317.

[52] YUAN Meng, LIU Bing, LIU Enmei, et al. Immunoassay for phenylurea herbicides: application of molecular modeling and quantitative structureactivity relationship analysis on an antigen-antibody interaction study[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83 (12): 4767-4774.

[53] ZHANG Song, DING Jingjing, LIU Ying, et al. Development of a highly enantioselective capacitive immunosensor for the detection of α-amino acids[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(21): 7 592-7596.

[54] PARKKINEN T, NEVA NEN T K, KOIVULA A, et al. Crystal structures of an enantioselective Fab-fragment in free and complex forms[J]. Journal of Molecular Biology, 2006, 357(2): 471-480.

[55] GRUBOR N, LIU Y, HAN X X, et al. High resolution spectral differentiation of enantiomers: benzo[α] pyrene tetrols complexed with a promiscuous antibody[J]. Journal of the American Chemical Society, 2006, 128(19): 6409-6413.

Advances in Immunoassay of Chiral Pesticides and Veterinary Drugs

ZENG Hao-peng, LEI Hong-tao*, ZHANG Chi-jian, SUN Yuan-ming, XU Zhen-lin, YANG Jin-yi
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangdong Provincial Engineering and Technique Research Centre of Food Safety Detection and Risk Control, Collaborative Innovation Center of South China Poultry Disease Prevention-Control and Product Safety, Guangzhou 510642, China)

The enantiomers of chiral drugs exhibit stereoselective differences in their metabolic transformation and toxicity in living organisms. Therefore, there is a need for deeper research and analysis of chiral pesticides and veterinary drugs in the form of enantiomers. Immunoassay has attracted increasing attention in the field of chiral pesticides and veterinary drugs because of its fast operation, high specificity and excellent sensitivity. The recent applications of immunoassay in the detection of chiral pesticides and veterinary drugs are summarized. Meanwhile, this paper presents a review of recent advances in the application of antibody stereoselectivity, molecular simulation and quantitative structure-activity relationship in the immune recognition mechanism. Moreover, future trends in the research and application of immunoassay in this field are discussed.

chiral; pesticides; veterinary drugs; immunoassay; recognition mechanism

TS207.3

A

1002-6630（2014）21-0315-07

10.7506/spkx1002-6630-201421060

2014-03-31

NSFC-广东联合基金项目（U1301214）；广东省自然科学基金项目（S2013030013338）；2013年度高等学校博士学科点专项科研基金项目（20114404130002）；广东省高等学校成果转化项目（cgzhzd0808）；公益性行业（农业）科研专项（201003008-08）

曾皓鹏（1988—），男，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：zenghp1988@163.com

*通信作者：雷红涛（1973—），男，教授，博士，研究方向为生物分析化学。E-mail：hongtao@scau.edu.cn