刺血加艾灸疗法对急性痛风性关节炎大鼠外周血单个核细胞TLR2与TLR4mRNA表达的影响

朱 艳

（安徽中医药大学附属针灸医院，安徽合肥 230061）

刺血加艾灸疗法对急性痛风性关节炎大鼠外周血单个核细胞TLR2与TLR4mRNA表达的影响

朱 艳

（安徽中医药大学附属针灸医院，安徽合肥 230061）

目的 探究刺血加艾灸疗法治疗急性痛风性关节炎的作用机制。方法 将40只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组、刺血艾灸组，每组10只，采用尿酸钠混悬液右后踝关节注射法复制痛风性关节炎大鼠模型。分别在模型复制时、模型复制后24h及灌胃治疗后3d测量右后足肿胀度；灌胃3 d后，从腹主动脉取血，检测血清尿酸（uric acid，UA）含量及外周血单个核细胞中Toll样受体2（toll－like receptor 2，TLR2）和Toll样受体4（toll－like receptor 4，TLR4）mRNA的表达水平。结果 与正常对照组比较，模型组大鼠足肿胀度，血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平均显著上调（P＜0.01）。刺血艾灸组足肿胀度，血清UA含量，TLR2、TLR4mRNA表达水平较模型组均显著下调（P＜0.05，或P＜0.01），且显著低于秋水仙碱组（P＜0.05，或P＜0.01）。结论 刺血加艾灸疗法能够降低痛风性关节炎大鼠的关节肿胀度及血清UA水平，其机制可能与外周血单个核细胞中TLR2与TLR4mRNA的表达水平下调有关。

痛风性关节炎；刺血；艾灸；Toll样受体；尿酸

痛风是由嘌呤代谢紊乱，血尿酸增高，导致尿酸结晶沉积在关节及皮下组织而引起的一种疾病。临床上以高尿酸血症、特征性急性关节炎、痛风结石形成为特点。痛风性关节炎就是由痛风引起的发病急骤的关节红肿和剧痛的关节炎症，受累关节疼痛难忍，活动受限，易反复发作。近年来，由于饮食结构变化，中国痛风发病率逐年升高，预计在21世纪，痛风在中国将成为仅次于糖尿病的第二号代谢病［1］。Toll样受体（toll－like receptors，TLRs）是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，其中TLR2与TLR4在急性痛风性关节炎发生发展过程中发挥重要的作用，已成为目前研究急性痛风性关节炎的热点。刺血疗法和灸法属于中医传统外治法，刺血疗法针刺局部可以促进和改善局部血液循环，加速炎性渗出物和致痛物质的吸收，缓解疼痛，使致痛因子尽早排除，促进经络修复。灸法具有温经、活血通络、清热解毒等功效，并且治疗过程中患者有舒适感，因此很受患者欢迎。本研究旨在观察刺血加艾灸疗法对急性痛风性关节炎大鼠TLR2与TLR4的调节作用。

1 材料

1.1 动物 清洁级Wistar雄性大鼠40只，体质量（200±20）g，由安徽省医学科学研究所动物房提供（合格证号：皖医实动准字03号）。实验室保持恒温、恒湿，动物在明暗周期各12h（明期6：00— 18：00）的条件下进行适应性饲养。

1.2 药品与试剂 秋水仙碱：每片0.5mg，吉林省通化百信药业有限公司生产，用生理盐水配成0.0135mg／ml的混悬液，备用。艾条：上海泰成科技发展有限公司。尿酸钠：由美国Sigma公司出品，批号127k7331。Trizol提取液：天根生化科技（北京）有限公司提供，批号DP517；PCR Master Mix试剂盒（货号K0171）、M－Mulv Reverse试剂盒（货号K1624）：均购自加拿大Fermentas公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RIPA裂解液购自江苏碧云天生物技术研究所（货号p0017B）。

1.3 仪器与设备 Penguin－600CL－OYLMPUS BX51图像分析系统：美国BIOPAC公司；PH070Am电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；Centrifuge 5417R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf；EPS－301电泳仪：美国Amersham公司；Gel Doc XR凝胶图像分析仪：美国Bio－RAD公司。

2 方法

2.1 模型复制方法［2］将大鼠右后踝关节屈曲，用手触摸，可扪及两骨突部，局部无菌操作后，用6号注射针自两骨突间进针，感觉有突破感后，证明针头进入踝关节内，注入0.2ml尿酸钠混悬液（浓度为100mg／ml），正常对照组注入等量生理盐水。注射尿酸钠混悬液24h后，观察右后踝关节，如有明显肿胀，即表明模型复制成功。

2.2 分组及给药 适应性喂养1周后，40只大鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组、刺血艾灸组，每组10只，后3组大鼠均进行模型复制。模型复制24h后对各组大鼠进行治疗。分组治疗3d，所有动物均在上午10：00—11：00定时治疗。各组均自由饮水和普食饲养。

2.2.1 秋水仙碱组［3］：先将秋水仙碱碾磨成粉，然后将其溶于生理盐水中以制成混悬液，每日按0.135 mg／kg剂量灌胃，共灌胃治疗3d。

2.2.2 刺血艾灸组：于右后踝关节最肿处去除周围皮毛，常规无菌操作后，以三棱针点刺，挤出血3～5滴，然后将大鼠仰卧位束缚在大鼠固定木板上，将艾条固定在自制艾灸架上，艾条点燃部位离穴位约3cm，每次10min左右，以局部皮肤潮红为度，每日1次，共3d。

2.2.3 正常对照组和模型组：予等量生理盐水灌胃，10ml／kg，每日1次，共3d。

2.3 观测指标与方法

2.3.1 一般观察：观察大鼠的外观、性情、活动等情况。

2.3.2 右后足肿胀度：试验前每只大鼠右后足踝关节处用记号笔作一清晰横线，分别于模型复制时、模型复制后24h及治疗后3d用自制容积测定仪［4］测量大鼠足趾容积。给药前肿胀度＝（给药前足容积－致炎前足容积）／致炎前足容积×100％，给药后肿胀度＝（给药后足容积－给药前足容积）／给药前足容积×100％。

2.3.3 血清尿酸（uric acid，UA）水平检测：末次治疗24h后，用20％乌拉坦溶液按0.5ml／kg剂量予腹腔内注射麻醉后，仰位固定。从腹主动脉取血约2ml，4 000r／min离心10min，取血清，采用酶比色法检测UA水平。

2.3.4 RT－PCR法检测TLR2、TLR4mRNA表达：末次治疗24h后，用20％乌拉坦溶液按0.5 ml／kg剂量予腹腔内注射麻醉后，仰位固定。从腹主动脉取血约2ml，置枸橼酸钠抗凝试管内，分离外周血单个核细胞，重悬于RPMI－1640培养基，置12孔塑料皿内，于37℃、含5％CO2的培养箱中培养60min后，Trizol法提取外周血单个核细胞的总RNA，生物紫外分光光度计测定RNA的纯度和总量。根据Gene Bank提供的引物序列，使用Primer 5软件设计并分析引物。以此RNA为模板，加入2.5mmol／L olig（dT）18及莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，M－MLV RT）。TLR2mRNA与TLR4mRNA扩增条件：94℃预变性2min，然后进行循环扩增，即97℃变性1.5min→56℃退火1 min→72℃延伸1min，循环次数分别为35、32次，最后再72℃延伸10min。内参扩增条件：94℃预变性2min，然后进行循环扩增，即95℃变性1.5 min→56℃退火1min→72℃延伸1min，循环36次，最后再72℃延伸10min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析。引物序列及反应条件、扩增长度见表1。采用Image－pro plus软件对条带进行分析，计算电泳条带的累积光密度（integral optical density，IOD），以TLR2、TLR4与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide－adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的IOD比值作为TLR2mRNA及TLR4mRNA表达的相对含量。

表1 各引物序列、反应条件、循环次数和扩增长度

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学处理，连续性变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述，等级资料采用秩和检验，两组间均数比较采用LSD法（方差齐）或Dunnett T3法（方差不齐）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况观察 实验期间，正常对照组大鼠行动灵活，反应灵敏。模型组大鼠出现关节肿胀，精神不振，患肢屈曲因痛不能着地。刺血艾灸组和秋水仙碱组大鼠精神状态明显好转，致炎关节肿胀明显减退，其中刺血艾灸组好转更为明显。

3.2 各组大鼠足趾肿胀度比较 致炎前各组大鼠足跖肿胀度无明显差异（P＞0.05）；模型复制后24 h，模型组、刺血艾灸组、秋水仙碱组大鼠足跖肿胀度显著高于正常对照组（P＜0.01）；治疗后3d，刺血艾灸组和秋水仙碱组大鼠足跖肿胀度较模型组显著减轻（P＜0.01），刺血艾灸组大鼠关节肿胀度显著低于秋水仙碱组（P＜0.01）。见表2。

3.3 各组大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平比较 与正常对照组相比，模型组血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，刺血艾灸组和秋水仙碱组血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平显著下降（P＜0.05，或P＜0.01）；刺血艾灸组血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平显著低于秋水仙碱组（P＜0.05，或P＜0.01）。见表3、图1。

表2 各组大鼠足趾肿胀度比较（±s）

表2 各组大鼠足趾肿胀度比较（±s）

注：与正常组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与秋水仙碱组比较，＃＃P＜0.01。

组 别n足趾肿胀度／％ 3d正常对照模型复制前模型复制后24h治疗后10 1.93±0.22 2.14±0.27 2.45±0.14模 型10 1.94±0.20 15.05±0.61＊＊14.55±0.61＊＊秋水仙碱10 1.94±0.18 14.97±0.51＊＊10.59±0.71＊＊△△刺血艾灸10 1.95±0.22 14.63±0.51＊＊6.61±0.87＊△△＃＃

表3 各组大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表达水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与秋水仙碱组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组 别n TLR2mRNA TLR4mRNA UA／（μmol／L）正常对照10 0.46±0.06 0.37±0.05 78.18±6.66模 型10 0.89±0.05＊＊0.80±0.05＊＊122.63±8.62＊＊秋水仙碱10 0.68±0.05＊＊△△0.68±0.06＊104.08±7.20＊＊△△刺血艾灸10 0.51±0.05＊＊△△＃＃0.53±0.07＊＊△△＃86.63±8.78＊△△△＃

图1 各组大鼠TLR2和TLR4mRNA表达水平比较（M.NADPH；a.正常对照组；b.模型组；c.刺血艾灸组；d.秋水仙碱组）

4 讨论

炎性细胞、细胞因子及炎性体对于痛风性关节炎的发生、发展直至自然缓解具有重要意义，其中炎性体包括细胞内大分子、多蛋白复合体，能够激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－1，促进促炎因子白细胞介素－1β（interleukin－1beta，IL－1β）和IL－18的加工和成熟，引起细胞死亡。TLRs是与痛风关系密切的细胞因子，是模式识别受体的一种，在抗感染免疫中首先被人们认识，其在固有免疫和炎性细胞因子的产生及信号传递过程中发挥重要作用，其中TLR2和TLR4协同链接蛋白髓样分化因子识别尿酸盐结晶，从而启动细胞信号级联放大，最终激活一系列促炎细胞因子和启动适应性免疫应答，这也是痛风发作的病理学标志［5］。近期研究发现，痛风急性发作期体内TLR2和TLR4的表达水平明显升高，而采用抗炎、调节免疫等干预治疗后则TLR2、TLR4表达水平明显下调［6］，这与针对敲除TLRs基因的缺陷鼠的研究结果相一致［7］。

痛风性关节炎属中医学“历节”“白虎历节风”“痹病”范畴。《针灸大成》谓其“病有三因，皆从气血”，《千金方》认为其病因为“热毒气从脏腑出，攻于手足”，朱丹溪在《格致余论》中指出痛风是“血中有热，再受风寒，热血得寒，痰浊凝涩引起”，这些均说明急性痛风性关节炎与血中瘀热有关。

中医学早已论及刺血疗法的作用机制。《素问·调经论》认为：“血有余，则泻其盛经，出其血，视其血络，刺出其血，恶血得入于经，以成其疚”；“病在脉，调之血；病在血，调之络”。《灵枢·小针解》：“除之者，去血脉也。”《素问·针解》说：“除之，出恶血也，邪胜则虚之，出针勿按。”使癖阻祛除、气血通畅，以达到治疗目的。中医学认为艾属温性，其味芳香，善通十二经脉，具有理气血、逐寒湿、温经、解毒等作用。在艾灸治疗过程中，艾叶燃烧后产生的温热效应渗透诸经，起到治疗作用。刺血及艾灸疗法现已被临床认可，尤其在治疗痛风性关节炎方面疗效确切［8－11］。

本研究结果提示：刺血加艾灸疗法能够缓解急性痛风性关节炎大鼠关节疼痛，改善关节肿胀度，下调尿酸水平，其机制可能与其下调TLR2和TLR4 mRNA表达水平有关。

［1］边丽娜，程宇.针灸治疗痛风性关节炎的疗效及机理研究进展［J］.针灸临床杂志，2009，25（7）：58－60.

［2］Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti－arthritic agents［J］.Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461－466.

［3］许延文.痹清胶囊抗痛风作用的实验研究［D］.哈尔滨：黑龙江中医药大学，2005：35.

［4］徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理学实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2002：920－921.

［5］Krishnan J，Selvarajoo K，Tsuchiya M，et a1.Toll－like receptors signal transduction［J］.Exp Mol Med，2007，39（4）：421－438.

［6］蒋莉，周京国，青玉凤，等.Toll样受体2和Toll样受体4及其信号通路在原发性痛风性关节炎发病机制中作用的研究［J］.中华风湿病学杂志，2011，15（5）：300－304.

［7］Liu－Bryan R，Scott P，Sydlaske A，et al.Innate immunity conferred by Toll－like receptors 2and 4and myeloid differentiation factor 88expression is pivotal to monosodium urate monohydrate crystal－induced inflammation［J］.Arthritis Rheum，2005，52（9）：2936－2946.

［8］金晨宇，孙梅，温成平，等.祛浊通痹颗粒对急性痛风模型炎症因子的调节作用［J］.中草药，2007，38（8）：1223－1225.

［9］李扬，任开明，蔡克银，等.威柏膏外敷治疗大鼠急性痛风性关节炎的实验研究［J］.中华中医药学刊，2012，30（7）：1587－1589.

［10］陈燕琴，李秀娟.针刺结合刺血疗法治疗急性痛风性关节炎临床研究［J］.湖北中医杂志，2013，35（3）：63－64.

［11］黎文杰.刺络放血配合中药外敷治疗急性痛风性关节炎43例疗效观察［J］.四川中医，2013，31（6）：142－144.

Effects of Moxibustion Combined with Blood－pricking Therapy on mRNA Expression of Toll－like Receptor 2 and Toll－like Receptor 4in Peripheral Blood Mononuclear Cells among Rats with Acute Gouty Arthritis

ZHU Yan
（The Acupuncture and Moxibustion Hospital Affiliated to Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230061，China）

Objective To investigate the action mechanism of moxibustion combined with blood－pricking therapy in the treatment of acute gouty arthritis.Methods Forty male Wistar rats were randomly and equally divided into normal control group，model group，colchicine group，and moxibustion／blood－pricking therapy group.A rat model of gouty arthritis was induced by injecting sodium urate suspension（0.2ml）into the right hind ankle joint.The degree of swelling of right hind foot was determined based on the toe volumes measured when the model was induced，at 24hafter the model was induced，and after 3dof treatment.Three days after treatment，blood samples were taken from the abdominal aorta，and the serum uric acid（UA）level and mRNA expression of Toll－like receptor 2（TLR2）and Toll－like receptor 4（TLR4）in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were measured.Results Compared with the normal control group，the model group had significantly increased foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.01）.Compared with the model group and colchicine group，the moxibustion／blood－pricking therapy group had significantly reduced foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.05or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion combined with blood－pricking therapy can reduce joint swelling and serum UA level in rats with gouty arthritis，which may be related to down－regulated expression of TLR2and TLR4in PBMCs.

gouty arthritis；blood－pricking therapy；moxibustion；Toll－like receptor；uric acid

R684.3

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.019

2013－07－21）

安徽中医学院青年科学基金项目（2012qn042）

朱艳（1977－），女，博士，主治医师