干细胞向胆管上皮细胞诱导分化的研究进展

颜 谭，祝旭龙，李建辉(综述)，吕 毅(审校)

(1.延安大学医学院，陕西 延安716000； 2.陕西省人民医院肿瘤外科，西安 710068；3.西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061)

干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生为各种组织细胞的潜能。目前，虽然人们对干细胞诱导分化的研究日趋成熟，但在体外诱导干细胞向胆管上皮细胞分化方面还存在一些不足，其研究大都停留在细胞转化层面，并未能深入到基因调控水平，且分化机制还不完全明确，有待于更进一步的研究。现就诱导干细胞向胆管细胞及肝细胞诱导分化的研究进展予以综述。

1 干细胞向胆管细胞分化潜能

干细胞种类繁多，其既能自我更新，又能被诱导分化[1]。不同种类的干细胞经诱导刺激可向胆管上皮细胞分化[2]。肝前体细胞，如肝原细胞、肝卵原细胞可诱导分化为胆管上皮细胞，卵圆细胞被认为是肝干细胞，这是因为它具有向肝细胞和胆管上皮细胞分化的双潜能性，并在移植后能够重建肝脏。李铸等[3]发现，肝原细胞既可以向肝细胞分化又可以向胆管细胞分化，其分化方向主要取决于细胞的外在刺激因素。Chen等[4]从鼠肝中提取了成纤维样肝前体细胞；而Malhão等[5]发现，肝前体细胞具有向胆管上皮细胞分化的潜能。另外，Dollé等[6]根据肝内细胞乙醛脱氢酶活性的高低分离肝原细胞，经过诱导可以表达肝细胞及胆管上皮细胞标志物。不同组织器官来源的间充质干细胞可诱导分化为胆管上皮细胞。Manohar等[7]发现，在成年鼠胆囊提取到的间充质干细胞，经诱导分化后可表达胆管细胞的表面标志物，并出现胆管样结构及囊性结构。人工诱导的多能干细胞在适当的条件下可表达相应的胆管上皮细胞标志物。

2 干细胞向胆管上皮细胞诱导分化的条件

目前，在体外诱导干细胞向胆管上皮细胞分化的方案比较少。诱导干细胞向肝细胞分化时，可表现出胆管的一些标志物，如角化蛋白19(cytokeratin-19，CK19)、γ谷酰胺转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)等；诱导干细胞向肝或胆管上皮细胞分化多采用化学药物刺激、与组织或细胞共培养、条件培养液刺激等方式，现多采用条件培养液刺激[8]。不同种属的干细胞诱导分化浓度可不同，向肝细胞转化主要依靠肝细胞生长因子(hepatocyte growth factors，HGF)、成纤维生长因子(fibroblast growth factors，FGF)、抑瘤素等[9]，向胆管转化时多采用HGF、表皮生长因子(epidermal growth factors，EGF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等[10]，刺激21 d左右即可完成转化。

2.1诱导分化刺激因子 目前所采用的刺激因子主要有HGF、TGF、FGF、EGF、角化生长因子，干细胞生长因子等；另外还可添加丙戊酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素、丁酸钠等组蛋白去乙酰化酶抑制剂对基因进行表观修饰，在基因层面调控干细胞向肝或胆管细胞的诱导分化；添加抑瘤素、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸等可促进肝或胆管细胞成熟。如采用丙戊酸钠与酸性成纤维细胞生长因子联合刺激胚胎干细胞方案[11]，亚油酸、地塞米松、维生素C、EGF、基膜、HGF、FGF4联合刺激人、小鼠及大鼠的骨髓间充质干细胞方案，EGF、HGF、FGF2、尼克酰胺、抑瘤素联合刺激人脂肪组织间充质干细胞方案等[12]。

2.2诱导分化刺激因子的水平 不同种属的干细胞诱导方案不同。国内最新发现，采用10 g/L HGF、10 g/L EGF可将SD大鼠的骨髓间充质细胞诱导分化为胆管上皮样细胞，其是目前采用的刺激因子诱导分化方案中浓度最大的[13]。Zhou等[14]分四步将小鼠胚胎干细胞诱导分化成肝细胞或胆管细胞，肝祖细胞诱导分化成胆管样细胞时，采用的是100 μg/L HGF、50 μg/L EGF，诱导分化2 d即可发现胆管样结构，并可持续存在5 d。Dong等[15]采用1 mmol/L的丙戊酸钠及10 μg/L HGF将少数的胚胎干细胞诱导分化成肝祖细胞后，再采用10 μg/L HGF、10 μmol/L地塞米松诱导分化30 d即可见到胆管样结构，这可能是诱导干细胞向胆管细胞分化所采用的诱导因子浓度最小的一种刺激方案。

2.3诱导分化刺激因子步骤 干细胞向肝胆管细胞诱导分化的过程一般分为3个步骤：抑制干细胞增殖并诱导其转向内胚层、向肝原细胞及肝胆管细胞转化，或按照胚胎发育过程，添加诱导因子诱导干细胞逐步分化成肝细胞或胆管上皮细胞。Nakamura等[16]采用人多能干细胞经向内胚层诱导、肝原始细胞形成及分化成熟肝细胞或胆管细胞3个阶段诱导分化，而后检测到肝或胆管细胞表达的特异性标志物，如α胎蛋白、白蛋白及细胞色素P450等；另外，在第二个阶段如采用向胆管诱导分化方案，可以检测到胆管标志物。Roelandt等[17]将胚胎干细胞按胚胎细胞发育过程逐步添加激活素A、Wnt3α(经Nodal/Crip通路和β联蛋白通路促使干细胞向原条、内胚层方向分化)、FGF(主要是由横膈或心脏间充质细胞分泌，促使原条、内胚层向肝芽方向生长)、HGF及卵泡抑素(促使肝芽向成熟细胞生长)，而后检测到成熟细胞的标志物。Zhou等[11]先采用丁酸钠抑制组蛋白去乙酰化酶干扰干细胞DNA与组蛋白结合，促进基因转录，然后与FGF联合刺激胚胎干细胞直接向肝样细胞分化，并使其成熟，该过程仅需10 d左右即可检测到成熟的肝细胞标志物。

3 干细胞向胆管上皮细胞诱导分化的机制

胆管细胞的诱导分化机制还尚不明朗，通过对胚胎发育过程的研究发现，胆管细胞的分化过程主要与Wnt/β联蛋白、Notch及TGF-β信号转导通路有关[18]。Wnt/β联蛋白信号通路在肝脏胚胎发育和控制肝母细胞分化方面起着关键作用。Notch信号通路参与调控胆管形态的发生和(或)胆管细胞存活，其也是胆汁网络形态发生和增殖扩张所需的。TGF-β通路是最早发现的胆管细胞信号通路，其能促进胆管细胞分化和管状结构形成，在该分化过程中抑制TGF-β的细胞因子表达，可阻止干细胞向胆管细胞分化。

4 胆管细胞的鉴定

细胞的鉴定主要是通过细胞的形态和细胞表面标志物，胆管上皮细胞的标志物有：Y染色体性别决定区域9，骨桥蛋白、肝细胞核因子1β、整合素β4、CK7、CK19、GGT、神经细胞黏附因子、人体上皮细胞抗原、糖蛋白34、小分子RNA等。其中，CK19及神经细胞黏附分子的表达提示该细胞具有向胆管细胞分化的潜能，在细胞成熟前表达量达最高水平。Raynaud等[18]研究发现，一些微RNA(micro RNA，miRNA)如miRNA-38、miRNA-30a以及 miRNA-30c在胆管细胞中特异表达，可用于胆管上皮细胞的检测；同时还发现抑制胆管形成的标志：转录因子3、叉头转录因子A1(forkhead box，FoxA1)、FoxA2、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)等，其中，转录因子3抑制胆管上皮细胞分化、促进肝细胞分化，FoxA1、FoxA2抑制胆管细胞增殖，C/EBPα通过抑制肝细胞核因子6和肝细胞核因子1的表达而抑制胆管分化，而且肝细胞核因子6与C/EBP间可能在调节胆管细胞分化方面存在上下调控或阶段依赖性关系。

5 诱导分化的意义及问题

干细胞诱导分化成胆管细胞可用于慢性、退行性、炎性及自身免疫性胆管病的治疗及研究[19]。危及生命的急性或慢性移植物抗宿主肝胆管疾病应用常规治疗无效时，应用骨髓间充质干细胞却能得到很好的治疗效果，而且采用分化的干细胞在治疗胆管疾病时会更稳定、更安全。目前，干细胞向肝胆管细胞诱导转化方式逐渐增多，且过程简单化，已深入到基因调控层面，分化的条件、机制、通道逐步明确，转化有效性和一致性不断提高。但目前干细胞在向胆管上皮细胞诱导分化方面还存在一些技术性难题，需要做进一步的研究[20]。

6 小 结

干细胞来源丰富、取材方便，且容易被分离纯化，更能被诱导分化。研究发现，多种干细胞可按照抑制细胞增殖并诱导其转向内胚层、再向肝原细胞及肝胆管细胞转化的步骤或按照胚胎发育过程逐步添加一定种类及适当剂量的刺激因子，诱导其向胆管样细胞分化并逐步表达胆管细胞的表面标志物[14]。目前，分化的条件、过程不断简化，机制逐步明朗，而且在疾病的治疗方面也取得了显著的进展。

[1] Shafritz DA,Oertel M.Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(2):198-213.

[2] Maerckx C,Scheers I,Tondreau T,etal.Hepato-biliary profile of potential candidate liver progenitor cells from healthy rat liver[J].World J Gastroenterol,2012,18(27):3511-3519.

[3] 李铸,李立,冉江华,等.大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究[J].中国现代医学杂志,2010,5(20):663-666.

[4] Chen Y,Zhou H,Sarver AL,etal.Hepatic differentiation of liver-derived progenitor cells and their characterization by microRNA analysis[J].Liver Transpl,2010,16(9):1086-1097.

[5] Malhão F,Urbatzka R,Navas JM,etal.Cytological,immunocytochemical,ultrastructural and growth characterization of the rainbow trout liver cell line RTL-W1[J].Tissue Cell,2013,45(3):159-174.

[6] Dollé L,Best J,Empsen C,etal.Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice[J].Hepatolgy,2012,55(2):540-552.

[7] Manohar R,Komori J,Guzik L,etal.Identification and expansion of a unique stem cell population from adult mouse gallbladder[J].Hepatology,2011,54(5)：1830-1841.

[8] 王宾,程云霄,吕云霄,等.大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化研究[J].中华实验外科杂志,2013,30(1):169-170.

[9] Lee JH,Lee KH,Kim MH,etal.Possibility of undifferentiated human thigh adipose stem cells differentiating into functional hepatocytes[J].Arch Plast Surg,2012,39(6):593-599.

[10] Burra P,Arcidiacono D,Bizzaro D,etal.Systemic administration of a novel human umbilical cord mesenchymal stem cells population accelerates the resolution of acute liver injury[J].BMC Gastroenterol,2012,12:88.

[11] Zhou M,Li P,Tan L,etal.Differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes induced by a combination of cytokines and sodium butyrate[J].J Cell Biochem,2010,109(3):606-614.

[12] Banas A,Yamamoto Y,Teratani T,etal.Stem cell Plasticity:learning from hepatogenic differentiation strategies[J].Dev Dyn,2007,236(12):3228-3241.

[13] 张诚,杨玉龙,林美举,等.体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化[J].中国组织工程研究,2013,17(1):17-22.

[14] Zhou QJ,Xiang LX,Shao JZ,etal.In vitro differentiation of hepatic progenitor cells from mouse embryonic stem cells induced by sodium butyrate[J].J Cell Biochem,2007,100(1):29-42.

[15] Dong XJ,Zhang GR,Zhou QJ,etal.Direct hepatic differentiation of mouse embryonic stem cells induced by valproic acid and cytokines[J].World J Gastroenterol,2009,15(41):5165-5175.

[16] Nakamura N,Saeki K,Mitsumoto M,etal.Feeder-free and serum-free production of hepatocytes,cholangiocytes,and their proliferating progenitors from human pluripotent stem cells:application to liver-specific functional and cytotoxic assays[J].Cell Reprogram,2012,14(2):171-185.

[17] Roelandt P,Sancho-Bru P,Pauwelyn K,etal.Differentiation of rat multipotent adult progenitor cells to functional hepatocyte-like cells by mimicking embryonic liver development[J].Nat Protoc,2010,5(7):1324-1336.

[18] Raynaud P,Carpentier R,Antoniou A,etal.Biliary differentiation and bile duct morphogenesis in development and disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(2):245-256.

[19] Behbahan IS,Duan Y,Lam A,etal.New approaches in the differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells toward hepatocytes[J].Stem Cell Rev,2011,7(3):748-759.

[20] 徐勇,周家华.组织工程化胆管中管状组织细胞培养及其与支架材料的相容性[J].江苏医药,2011,37(1):12-15.