污染土壤中功能性菌种的分离与鉴定

2014-03-08赵雨亭四川大学生命科学学院

油气田地面工程 2014年12期

赵雨亭四川大学生命科学学院

污染土壤中功能性菌种的分离与鉴定

赵雨亭四川大学生命科学学院

从污染土壤中分离纯化出3种具有降解原油作用的土著活性菌种S1、S2、S3，其中S1和S2菌种为芽孢杆菌，S3菌种为葡萄球菌。与进口生物修复剂Oil—Gator中分离出的OG菌种相比，S2菌种原油降解能力优于OG菌种，S1菌种与之相当，S3稍弱。为保证菌剂中菌种的多样性，使其能够有效地抵抗环境的冲击，确定菌剂培养方式为S1～S3混合培养。

污染土壤；土著微生物；菌种；降解试验

污染土壤中存在着可降解石油烃的微生物，它们对环境的适应性强且污染过程中已经历一段自然驯化期，因而是生物降解的首选菌种。本试验以长期被石油污染的土壤中的微生物为菌源，从中分离纯化出高效的具有原油降解作用的菌种。对分离得到的菌种开展菌种降解原油试验，通过比较原油去除率筛选出功能性菌种，并与进口药剂Oil—Gator进行除油效果对比。

1 菌种分离纯化

取大庆油田北I—2联合站附近污油回收池边10cm表层土壤，用于菌种的分离筛选工作。菌种富集、分离和纯化过程如下：取5g原油污染土壤样品（或1g污油降解素）置于液体LB富集培养基中，在30℃、200r/min的条件下液体富集培养；连续培养4代，每代培养至指数生长末期后以1%～2%的接种量进行转接；当最后一代培养结束后，用微量移液器移取50μL细胞培养液涂布于平板培养基上，为确保获得高度分散的单菌落，采用连续涂布的方法，共涂布5块平板；平板置于30℃环境中，经过约28～32h培养后形成单菌落；根据单菌落的外观形态（包括菌落形状、颜色、中央隆起程度、边缘形状及透明程度等感官指标），选取优势生长、数量居多、形态不同并且高度分散的单菌落至LB营养琼脂斜面上画线培养；待斜面上形成菌苔后置于4℃冰箱中保存、备用；革兰氏染色、镜鉴，判断斜面是否为纯菌；不纯菌株通过平板画线或液体富集培养后涂布进行二次纯化。最终，从土著微生物中共分离出8支纯培养微生物菌株，编码序号为S1～S8。

2 菌种功能特性试验

对从土壤中分离出来的8支菌种S1～S8及从Oil—Gator中分离出来的5支菌种OG1～OG5进行原油降解试验。试验主要分为菌种活化、降解原油、取样检测分析三个阶段。

经过120h的原油降解试验，测定含油量，计算各菌种原油降解率，每个菌种平行测定3～5次。试验结果表明，OG1～OG5菌种原油降解能力接近，降解率在9.1%～9.42%之间浮动；S1～S8菌种原油降解能力差别较大，其中S2菌种效果最佳，优于OG进口药剂中菌种的降油能力，S1菌种与之相当，S3稍弱。S4～S8菌种原油降解能力较差。

选取S1、S2、S3菌种作为土著活性菌种进行混合培养后，考察其原油降解率。试验结果表明，用S1～S3菌种混合培养方式进行的原油降解试验，其原油降解率达到9.48%，仅次于用S2菌种单独培养方式的原油降解能力。

取S1～S3菌种，委托天津科技大学生物工程学院发酵工程国家重点实验室进行菌种鉴定。试验结果表明，Oil—Gator中分离出的5支菌种OG1～OG5菌均为奥德赛芽胞杆菌，S1菌为蜡样芽胞杆菌，S2菌为溶血不动杆菌，S3菌为克氏葡萄球菌。