长链非编码RNA HOTAIR在肿瘤中的研究进展

庹 磊，李苏卿，汪春梅(综述)，曹秀峰(审校)

(南京医科大学附属南京医院肿瘤外科，南京 210006)

全球肿瘤统计显示，2008年全球新发恶性肿瘤约为1270万例，恶性肿瘤致死约为760万例[1]。近几十年来，国内外肿瘤相关研究已在多个领域取得了一系列成果，但肿瘤的确切发病机制仍在研究探索之中。长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)是一类具有调控功能的非编码RNA，由Okazaki等[2]在小鼠全长cDNA文库中首次发现，但其一度被认为是基因组的“转录噪音”，不具备任何生物学功能[3]。新近研究发现，LncRNA参与基因的转录和翻译及表观遗传等多种生物学过程，其调控作用较微RNA(microRNA，miRNA)更为广泛和复杂[4]。同源盒(homeobox，HOX)基因转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是迄今为止为数不多、功能和机制研究较为明确的LncRNA。该文主要关注HOTAIR在多种肿瘤中表达、功能及机制研究，结合目前本领域的最新研究进展，探讨LncRNA在肿瘤发生、发展中的作用。

1 HOTAIR的发现及序列进化

HOTAIR是一种典型的反义LncRNA，也是第一个被发现具有反式转录作用的LncRNA。Rinn等[5]对人体11种成纤维细胞中转录自HOX基因的非编码RNA进行了研究，共鉴定了231个LncRNA，在研究位于第12号染色体的HOXC基因座时意外发现了一种特殊的LncRNA，其作用方式与其他LncRNA不同，主要通过反式作用沉默染色质，且编码该LncRNA的DNA仅一条链可以被转录，与HOX基因序列亦不在同一条DNA链上，故将其命名为HOTAIR。

He等[6]研究发现，HOTAIR仅存在于哺乳动物的基因组序列中，全长约2158 nt，位于染色体12q13.13的HOXC11与HOXC12基因之间，共含6个外显子，包括5个短外显子及1个长外显子，进一步研究发现，HOTAIR进化过程显著快于邻近的HOX基因，且同源HOTAIR基因外显子存在不同的进化特征，HOTAIR基因序列保真度比较低，但结构具有高度保守性，长外显子6的B结构域尤为保守，提示其可能为HOTAIR的核心功能区域。

2 HOTAIR的功能机制

多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)主要由果蝇zeste基因增强子人同源体2、zeste12抑制子及外性梳蛋白基因组成。EZH2作为PRC2催化亚基，通过其组蛋白甲基转移酶中高度保守SET结构域{由最早发现表达此结构域的3个基因命名[7]：Su(var)3-9、Enhancer of zeste[E(z)]、Trithorax(trx)}催化H3组蛋白27位赖氨酸三甲基化进而沉默特定基因的转录，在染色体水平调控基因活性。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶 1(lysine specific demethylase 1，LSD1)属于胺氧化酶家族成员，与共阻遏蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)形成复合体，而CoREST类似于桥接作用将LSD1与神经元基因沉默转录因子(RE1-silencing transcription factor，REST)连接在一起，形成LSD1/CoREST/REST复合体，介导H3组蛋白第4位赖氨酸去甲基化进而调控靶基因的转录活性。Tsai等[8]探讨了HOTAIR、PRC2和LSD1三者间的关系，结果表明，HOTAIR具有特异性双向结合的能力，即5′端结构域与PRC2复合体结合，同时其3′端结构域与LSD1/REST/CoREST复合体结合，HOTAIR又可作为脚支架引导PRC2和LSD1形成复合体，并介导该复合物至特定的基因组位点，使该染色体H3组蛋白27位赖氨酸三甲基化及H3组蛋白第4位赖氨酸去甲基化，从而使染色体处于封闭状态，继而使其相应下游基因沉默。进一步研究显示[8]，与HOTAIR结合的PRC2功能区域映射于HOTAIR的1～300核苷酸，而LSD1映射于HOTAIR的1500～2146核苷酸。生物信息学分析及RNA印迹技术证实，PRC2和LSD1与HOTAIR结合的结构域具有广泛不同的二级结构，HOTAIR存在两个独立的结合位点(PRC2及LSD1)，在PRC2及LSD1之间起着“桥梁”作用，进一步证实HOTAIR对PRC2与LSD1之间的相互作用是必需的。LSD1和PRC2已被证实对多数基因的转录具有重要的调控作用，因此HOTAIR表达水平的改变极有可能引起复杂的生物学级联效应。

3 HOTAIR与肿瘤的关系

目前已发现LncRNA在多种肿瘤中差异性表达，而HOTAIR的研究相对比较深入。众多研究证实，HOTAIR在乳腺癌[9]、食管癌[10]等多种实体肿瘤中均高表达，且与肿瘤细胞侵袭转移、肿瘤复发及预后不良等均密切相关。

3.1HOTAIR与乳腺癌 Gupta等[9]首先证实，H0TAIR在原发性与转移性乳腺癌组织中均显著高表达，且转移灶中HOTAIR表达水平高出正常上皮组织200～2000倍；进一步体外实验显示，过表达HOTAIR能够促进多种乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，反之，沉默内源性HOTAIR表达，则可显著抑制肿瘤细胞的侵袭力，提示HOTAIR高表达可能是引起乳腺癌转移的重要原因；而体内研究揭示，静脉注射过表达HOTAIR细胞，使肺转移率较对照组细胞高10倍，并证实过表达HOTAIR可促使原本低转移活性的SK-BR3细胞向肺脏大量转移，进一步证实了H0TAIR表达与乳腺癌转移紧密相关。Bhan等[11]研究发现，雌二醇可诱导HOTAIR转录，表明HOTAIR转录启动子区域存在雌二醇多功能反应元件，此机制有助于解释高表达HOTAIR及乳腺癌进展。以上研究表明，HOTAIR不仅可作为临床潜在的乳腺癌患者术后转移预测指标及是否进行辅助放化疗的参考指标，其对肿瘤细胞生长及凋亡的调控作用也提示可针对此靶点开发新的肿瘤特异性单抗药物。

3.2HOTAIR与食管癌 前期研究采用荧光定量聚合酶链反应检测了78例食管鳞癌及正常组织，发现HOTAIR的表达水平在癌组织中普遍高于癌旁组织，HOTAIR高表达与食管鳞癌转移、临床TNM分期及总体生存率均紧密相关，且多因素分析显示与TNM分期及淋巴结转移相比，HOTAIR是独立的预后因子；进一步体外实验证实，HOTAIR在食管鳞癌细胞系中KYSE30细胞株的表达水平最高，采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术敲降HOTAIR，可显著降低KYSE30细胞的侵袭和转移能力，并显著增加细胞凋亡率，证实HOTAIR不仅参与食管鳞癌的发生、发展，而且其在肿瘤转移及预后判断中所体现出来的独特价值提示其极有可能是潜在的新药作用及治疗靶点，为食管癌患者的治疗带来新的希望[10]。

3.3HOTAIR与肝癌 Yang等[12]研究发现，HOTAIR在肝癌组织中高表达，其高表达水平也是肝癌肝移植患者监测术后复发的独立预后因子，并且在超出米兰标准的患者中，高表达HOTAIR患者的无复发生存时间更短；体外实验发现，以siRNA敲降肝癌细胞系中HOTAIR表达可明显降低细胞生存、侵袭及致敏肿瘤坏死因子α诱导的凋亡，也可显著增加肝癌细胞对化疗药物顺铂和多柔比星的敏感性。另一项研究发现，HOTAIR缺失可减缓细胞增殖，降低间质金属蛋白酶及血管内皮生长因子蛋白的表达，这对细胞侵袭及转移功能非常重要[13]。以上研究表明，HOTAIR的表达水平不仅与肝癌患者术后的预后评估相关，而且与肝癌患者对铂类制剂和多柔比星的耐药性及肝癌细胞侵袭转移功能均密切相关，因此研究HOTAIR确切的功能也有助于临床解决肝癌患者术后的预后评估、肿瘤复发及化疗耐药等问题。

3.4HOTAIR与胰腺癌 Kim等[14]研究显示，HOTAIR在胰腺肿瘤组织中高表达，且其表达水平与肿瘤侵袭及转移呈正相关，同时高表达HOTAIR患者的总体生存较差，以siRNA技术敲降HOTAIR，则可降低细胞系(Panc1及L3.6pL)增殖能力，减缓周期进程，降低侵袭能力及增加细胞凋亡；裸鼠成瘤实验显示，敲降HOTAIR可抑制裸鼠肿瘤的生长，表明HOTAIR在胰腺癌进展中发挥抗增殖的作用；进一步采用免疫共沉淀法显示，HOTAIR介导的基因抑制既有PRC2依赖性也有非PRC2依赖性，即HOTAIR至少存在两个功能区域，这与Tsai等[8]的研究结果相吻合。

3.5HOTAIR与肺癌 Nakagawa等[15]研究显示，HOTAIR表达水平与非小细胞肺癌的临床分期、淋巴结转移或淋巴血管侵袭及无病生存呈正相关，且过表达HOTAIR可诱导细胞系A549的侵袭及增殖。Liu等[16]研究证实，HOTAIR在非小细胞肺癌组织中高表达，且高表达水平与其进展期病理分期及淋巴结转移相关，高表达HOTAIR的患者预后相对较差。体外实验显示，以siRNA 敲降可降低癌细胞侵袭、迁移能力，而在体内则可抑制细胞转移，同时，敲降或过表达HOTAIR均可引起HOXA5的表达水平，即HOTAIR可能通过调控HOXA5发挥致癌基因的作用[16]。另一项研究发现,HOTAIR在顺铂抵抗型肺腺癌细胞系中显著性高表达，而在顺铂敏感的肺腺癌组织中低表达，且其低表达水平与p21呈负相关；体内及体外实验显示，以siRNA敲降HOTAIR可使肺腺癌细胞对顺铂再次敏感，反之过表达HOTAIR可降低细胞对顺铂的敏感性；研究还发现,以siRNA敲降HOTAIR可抑制细胞增殖，诱导细胞周期G1期阻滞及增加凋亡，另外过表达或敲降p21可产生类似于敲降或过表达HOTAIR后肺腺癌细胞系对顺铂产生的敏感性效应，而且敲降或过表达p21可补救敲降或过表达HOTAIR对p21及顺铂产生的效应，表明HOTAIR的生物学功能与p21调控通路相关[17]。

3.6HOTAIR与其他肿瘤 Li等[18]研究了HOTAIR与喉鳞状细胞癌之间的关系，荧光定量聚合酶链反应结果证实HOTAIR在喉鳞状细胞癌组织中显著性高表达，且其表达水平与预后呈显著负相关，进一步体外实验显示，以siRNA敲降HOTAIR可减少细胞株Hep-2侵袭，而增加细胞凋亡，研究还发现细胞株Hep-2内HOTAIR缺失则细胞PTEN甲基化显著性降低。Nie等[19]研究结果显示，HOTAIR在鼻咽癌组织中也呈高表达，较正常组织高5.2～48.4倍，且其表达水平与临床分期呈正相关，而与总生存率及预后呈负相关，体外实验显示HOTAIR表达可影响鼻咽癌细胞迁移、侵袭及增殖能力。Kogo等[20]研究HOTAIR表达与结肠癌的关系，表明HOTAIR在癌组织中显著性高表达，且其表达水平与肝转移及结肠癌术后的预后评估紧密相关，而且高表达HOTAIR患者预后更差。Niinuma等[21]研究发现，胃肠间质瘤中HOTAIR及miR-196a均高表达，且表达水平与风险分级、侵袭转移能力及生存率相关，进一步以siRNA敲低HOTAIR，则可抑制胃肠间质瘤细胞侵袭能力，说明HOTAIR不仅与上皮来源肿瘤的转移和侵袭能力相关，而且还与间质瘤的侵袭相关，这项研究拓宽了HOTAIR介导肿瘤转移的范围，提示HOTAIR在调控肿瘤的转移中具有普遍意义，也表明HOTAIR与miRNA存在一定关系，共同参与基因表达调控。

4 小 结

目前，越来越多的LncRNA被鉴定，但LncRNA的功能及机制尚未明确。新近研究发现，部分LncRNA可作为内源性竞争性RNA与某些靶miRNA竞争性结合，从而解除miRNA对靶信使RNA的抑制作用，进而发挥特定的生物学功能[22]。Cesana等[23]报道，LncRNA-MD1以“海绵机制”吸附miR-133与miR-135，进而调控转录因子Mastermind样蛋白1和肌细胞特异性增强因子2C表达，从而活化肌肉特定基因的表达，影响肌肉分化。Wang等[24]在肝癌组织中证实，肝细胞癌上调LncRNA可与miR-372竞争性结合，上调miR-372靶基因cAMP依赖性蛋白激酶激动剂β的表达，促使肿瘤细胞持续存活。HOTAIR若能与某个或某类miRNA竞争性结合，进而发挥特定的生物学功能，则不仅揭示HOTAIR全新的作用机制，丰富ncRNA-蛋白质调控网络，而且可能为探索肿瘤发生、发展的分子机制带来新线索，为筛查临床肿瘤、制订个体化治疗方案、监测肿瘤复发及评估预后提供可靠的依据。

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