毕氏肠微孢子虫基因分型及公共卫生学重要性

刁瑞南，肖立华，宋铭忻，李 巍*

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.美国CDC 新发与人兽共患传染病研究中心)

微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的真核生物，广泛存在于无脊椎动物如蜜蜂、蚕和几乎所有种类的脊椎动物中。在已知并被命名的1 200 多个虫种中，共有8 个属中的14 个虫种可以感染人，其中毕氏肠微孢子虫(E.bieneusi)、兔脑炎微孢子虫(E.cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)以及海伦脑炎微孢子虫(E.hellem)较为常见[1-3]。E.bieneusi 是感染人和动物最常见的病原体，能导致免疫妥协或低下者长期的致死性腹泻，也能够导致免疫功能正常者剧烈的自限性腹泻[2-3]。它广泛寄生于低等生物和其它高等哺乳动物，动物可能是人微孢子虫的宿主。微孢子虫孢子也广泛存在于水源中，美国国立卫生研究院(NIH)将其列为B 类生物防范病原体，美国环境保护协会(EPA)将其列为能够导致水源性暴发流行的微生物类污染物。近年来，不断在家畜、宠物、野生动物及水源中检测到E.bieneusi，这引起各国研究者对微孢子虫病人兽共患传播和水源性传播的高度关注[1-3]。

目前，微孢子虫已被划分为真核生物中的真菌界，而在过去，曾一度被认为是藻类、肿瘤细胞、酵母的孢子甚至是原虫，但现在许多研究者仍将其视为原虫[1-3]。微孢子虫具有真核生物中最小的基因组，而且缺少自身代谢的相关基因，主要依赖宿主的代谢产物生存[1-3]。E.bieneusi属于真菌界(Fungi)、微孢子虫门(Microsporidia)、无膜泛成孢子虫亚目(Apanspor oblastina)、肠孢子虫科(Enterocytozoonidae)、肠孢子虫属(Enterocytozoon)[1-2]。E.bieneusi 是否存在有性生殖阶段尚不明确，其生活史大致包括：呈卵块发育的原形体阶段、呈孢子生殖的原形体阶段、孢子母细胞阶段和孢子阶段，这4 个阶段均与宿主细胞质直接接触。孢子侵入细胞时伸出极管穿入宿主细胞，将孢子质通过中空的极管注入宿主细胞胞质内。孢子质在靠近宿主细胞核的空泡内通过裂体增殖和孢子增殖，发育为孢子。孢子从破裂的宿主细胞中释放并随粪便排到外界环境，被其他宿主摄入并传播[1-3]。

1 检测和基因分型

早期对E.bieneusi 的鉴定主要根据其孢子大小、孢子核的形态特征、极丝圈的盘绕数及病原与宿主间的相互作用关系等。微孢子虫孢子是高度专性的，对外界环境有较强抵抗力，不同虫种间大小和形状各不相同[1-3]。微孢子虫孢子大小仅为1 μm～3 μm，在光学显微镜下很难区分不同虫种。E.bieneusi 多克隆抗体能够区别脑炎微孢子虫属用于微孢子虫病临床诊断[1-3]。

目前，分子诊断方法被广泛用于鉴定E.bieneusi 基因型。由于E.bieneusi 不同分离株SSU rRNA 基因的内部转录间隔区(ITS)差异较大，因此将其作为基因型鉴定的标准，不同基因型具有不同的生物学特性[1]。迄今为止，共鉴定出141 种基因型，有的来源于单一宿主，有的来源于多宿主。在以往的研究中，同一基因型常被冠以不同的名称(例如基因型D 也被命名为WL8、Peru9、PigEBITS9、PtEb VI 和CEbC)，这种相同基因型多重命名的结果造成了新基因型鉴定的混乱。目前，已经规定以首次报道的E.bieneusi 基因型名称为标准名称[4]。通过系统进化分析已经将141 种E.bieneusi 基因型划分为不同的遗传组(Groups 1-5)，Groups 2-4 中的基因型只感染人或特定的动物宿主，但没有显著的公共卫生学重要性；Group 1 中的基因型对人和动物都能感染，它们具有人兽共患可能性[5]。结合多位点序列分型及群体遗传学研究，将有助于了解该病原微生物的传播途径和机制[6-7]。目前，微孢子虫病的人兽共患传播机制及传播途径仍不清楚。

2 宿主范围

E.bieneusi 的宿主主要为人、家畜、野生动物及鸟类。其中包括人、猕猴、绒猴、狒狒、猪、马、牛、羊、犬、猫、狐狸、浣熊、水獭、河狸、家鼠、豚鼠、麝鼠、兔、鸡、猎鹰、鸽子和鹦鹉。据不完全统计，目前报道的共有141 种基因型。其中29 个在人和动物的感染中均有发现，46 个基因型仅在人的感染中发现，其余66 种基因型仅在家畜、野生动物及鸟类中发现(表1)。

表1 毕氏肠微孢子虫基因型宿主及地域分布Table 1 Design of the synthesized peptide sequence

2.1 人 微孢子虫被认为是分布最为广泛的具有遗传多样性的肠道病原体，超过90 %的人微孢子虫病由E.bieneusi 引起[1-3]。与发达国家相比，在发展中国家具有更高的感染率[1-3]。1985 年，在长期腹泻的艾滋病人体内首次发现E.bieneusi，能够导致艾滋病病人持续性腹泻，并危及生命[1-3]。疾病的产生是由于微孢子虫在小肠绒毛上皮细胞内复制，致使肠绒毛缩短及绒毛覆盖面积减少，从而导致吸收不良和腹泻症状的产生[2]。E.bieneusi 的感染还可能扩散到肝胆管系统导致胆管炎，其在肺部感染的病例也有报道[2]。研究显示，长期腹泻病人微孢子虫病的流行率显著高于正常人[2]。由E.bieneusi 所引起的有症状和无症状的感染也在免疫功能正常人群中出现，这类人多为出现免疫抑制反应或由于疾病引起的免疫力减弱的患者[2]。此外，免疫力正常的健康人也能感染该病原体，多发生自限性腹泻[2]。

目前，仅在人中检测到的E.bieneusi 基因型有B、Q、R、S、T、U、V、W、Peru3、Peru13、Peru15、CAF2、CAF3、CAF4、III、V、NIA1、HAN1、UG2145、Peru17、S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、CHN2、CZ1、CZ2、CZ4、CZ5、CZ6、Henan-II、Henan-III、Henan-IV、Henan-V、MAY1、IH、Nig1、Nig2、Nig3、Nig4、Nig5以及KIN-3 共计46 种[1,6,8-15]；在人及其他动物中均检测到的基因型有D、CAF1、EbpC、Peru10、Peru16、IV、WL11、O、PigEBITS7、Peru6、WL15、I、J、BEB4、CHN3、CHN4、EbpA、PigEBITS5、Henan-I、H、EbpD、A、Peru7、Peru11、WL7、C、CZ3、Peru8 和S6 共计29种[1,8-10,12-14,16-23]。以上基因型中的EbpC、D、IV、PigEBITS7、EbpD、Peru8、Peru11 和Henan-I 至Henan-V 曾在我国河南的人感染中报道[13]。基因型I、J、BEB4 和CHN2 至CHN4 曾在我国长春地区的人感染中发现[10]。

2.2 非人灵长动物 非人灵长动物与人亲缘关系相近，因此怀疑其能携带对人有感染力的E.bieneusi 基因型。新西兰灵长动物研究中心最早在猕猴中鉴定出具有人兽共患可能性的基因型D[1]。2006 年，在葡萄牙的绒猴中发现了基因型PtEb XII[1]。2011 年，在肯尼亚的狒狒中鉴定出能感染人的基因型D、A、Peru7、Peru11 和新基因型KB-1至KB-6[20]。2012 年，在我国贵州猕猴中鉴定出能感染人的基因型Peru11、WL15、EbpC、IV 和新基因型Macaque1[14]。

2.3 猪 目前，在世界各地猪中检测到的基因型包括D、CAF1、EbpC、Peru16、O、PigEBITS7、BEB4、EbpA、PigEBITS5、Henan-I、H、EbpD、G、PigEBITS1、PigEBITS2、PigEBITS3、PigEBITS4、PigEBITS6、PigEBITS8、E1、F1、CHN7、CHN8、CHN9、CHN10 和EbpB[1,10]。其中绝大部分基因型对人有致病力。

2.4 宠物动物 在葡萄牙、瑞士、哥伦比亚、中国和日本均有犬感染E.bieneusi 报道，宿主多为家犬及庇护所内的犬。检测到的基因型有IV、D、WL11、Peru6、PtEb IX、CHN5 和CHN6，前4 种为人兽共患的基因型[1,10]。其中在瑞士犬中发现的基因型PtEb IX，与现有的所有基因型的ITS 序列差异均显著，因此被广泛用于系统进化分析中的参考序列[10,13,20]。

在哥伦比亚、德国、葡萄牙、瑞士以及日本均有猫感染E.bieneusi 的报道。宿主为几月至五岁大的家猫和流浪猫，感染多无临床症状。基因型包括对人有感染力的Peru10、IV、WL11 和其它4 种：L、PtEb IV、PtEb VIII 和Like-D[1]。

2.5 反刍动物 已报道的关于牛E.bieneusi 基因分型的研究多集中于德国、美国和韩国的大型牧场。检测到的基因型有D、IV、Peru6、I、J、BEB4、CHN3、CHN4、EbpA、BEB3、BEB6、BEB7、BEB8、BEB9、4948 FL-2 2004、PtEb XI、CEbA、CEbD、CEbF、M 和N[10,23]。其中基因型I、J、BEB4、CHN3 和CHN4 在我国长春地区牛的感染中发现[10]。

有关羊感染E.bieneusi 的报道很少。应用PCR 技术，仅在西班牙的山羊中确定出一例阳性，但未鉴定出其基因型[1]。

2.6 马 目前仅在哥伦比亚和捷克的马中检测到E.bieneusi，其中幼年马的感染率显著高于成年马，鉴定出了对人具有感染力的基因型D、WL15、EbpA、G 和新基因型Horse1 至Horse11[1,19]。

2.7 啮齿动物 西班牙3 只农场饲养的家兔及一只野兔被报道携带E.bieneusi[1]。

在捷克与德国边界处家鼠和野生鼠中发现的E.bieneusi 基因型为D、EbpA、PigEBITS5、H、C、CZ3、Peru8 和S6，均为人兽共患基因型，总感染率约10.7 %，有合并感染的发生[21]。鼠作为一种常用的实验动物，也可以用于E.bieneusi 感染的研究。实验结果表明，免疫缺陷或抑制的小鼠经口接种纯化过的E.bieneusi 孢子后可以持续感染达18 个星期之久[1]。

2.8 野生动物 美国在海狸、狐狸、麝鼠、水獭、浣熊中均分离鉴定出E.bieneusi，其基因型包括D、EbpC、WL11、WL15、WL7、WL1、WL2、WL3、WL4、WL6、WL9、WL10、WL12 和WL14，前5 为人兽共患基因型[1]。

2.9 鸟 类 在鹦鹉、猎鹰、原鸡和鸽中检测到的E.bieneusi 基因型包括J、D、Peru6、A、EbpA、col01、col02、PtEb II 和Peru6-var，前5 种为人兽共患基因型[1]。

3 展 望

中国有关微孢子虫病的研究鲜有报道，缺乏动物微孢子虫病流行病学资料和数据。但在发达国家和一些发展中国家，基于ITS 序列的分型方法已广泛用于评价和分析人与动物及动物与动物之间E.bieneusi 传播的可能性，同时用于评价或分析人微孢子虫病的传染源[1]。目前对微孢子虫病尚无有效的防治方法，ITS 序列分型将增进对微孢子虫病传播方式的了解，同时有助于制定相应的预防措施。E.bieneusi 生活史中是否存在有性生殖阶段仍不清楚，而且ITS 序列分型分辨率欠佳，在鉴定重组基因型时存在一些不足，这需要借助多位点序列分型与群体遗传学工具，深入了解该病原体的生殖方式和传播机制[6-7]。

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