人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养

王玉强 黄黎亚 王飞 曹青 桑甜甜 陈书艳

.基础研究.

人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养

王玉强 黄黎亚 王飞 曹青 桑甜甜 陈书艳

目的 建立一种稳定的体外分离和培养人脐血来源内皮祖细胞的方法。方法 采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞，将其接种至人纤维连接蛋白包被的六孔板中，用EGM-2培养基诱导培养。通过形态学观察、细胞表面特异性抗原、摄取功能和体外血管形成能力对内皮祖细胞进行鉴定。结果 细胞形态学观察发现，刚分离的单个核细胞较小，呈圆形，4 d后可见少量的圆形和梭形贴壁细胞，8 d后有明显集落形成，14 d后相邻集落相互融合，呈现出典型铺路石样改变。内皮祖细胞能摄取乙酰化低密度脂蛋白，结合荆豆凝集素1，表达CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体2，并且具有体外血管生成能力。结论 采用密度梯度离心法可从人脐带血中成功分离和培养出内皮祖细胞，以用于相关实验研究。

人脐血； 单个核细胞； 内皮祖细胞； 细胞培养

动脉粥样硬化是老年人最为常见的病理改变，血管内皮细胞损伤和功能紊乱是动脉粥样硬化发生发展的始动因素。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs)参与了机体血管内皮的修复，对维持血管完整性和正常功能具有重要作用。EPCs是一类能定向分化为成熟内皮细胞的成体干细胞。研究表明，损伤的血管内皮可以通过EPCs分化再生，促进损伤血管再内皮化的形成，并限制动脉粥样硬化的发展［1-2］。为了研究EPCs的功能和作用，建立一种稳定的体外分离培养方法是首要前提。我们课题组前期曾用流式细胞仪分选脐血CD133和CD34双阳性的单个核细胞的方法来获取EPCs［3］，用这种方法虽然能获得较高的纯度，但是得到的细胞数量非常少，只占所有单个核细胞的0.1%，且费用较高。为了降低费用同时保证获得细胞的纯度，本研究通过密度梯度离心法从脐血中分离单个核细胞，再通过添加特定的细胞因子进行体外诱导分化，从而获得EPCs以用于后续相关实验研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

淋巴细胞分离液Histopaque-1077、FITC-UEA-l（Sigma公司)；Dil-AcLDL（Molecular Probes公司)；人纤维连接蛋白Fibronectin（Gibco公司)；兔多克隆CD34抗体、羊多克隆CD133抗体、兔多克隆VEGFR-2抗体（Santa Cruz公司)；EGM-2MV BulletKit（Lonza公司，包括EBM-2培养基和EGM-2MV Single Quots生长因子:FBS，hFGF-B，HYDROCORTISONE，R3-IGF-1，VEGF，hEGF，ASCORBIC ACID，GA-1000)；Matrigel胶（BD公司)；倒置荧光显微镜（Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 人脐血EPCs的分离培养 人脐静脉血采自上海交通大学医学院附属新华医院产科，经产妇本人、产妇家属及新华医院医学伦理委员会同意。选取年龄20～30岁健康足月顺产产妇的胎盘，脐血来源的产妇HIV、HBV、HCV、TP等病毒检测结果均为阴性，采集脐血20 ml（脐血中加入肝素抗凝)，并加40 m l（2倍体积)的PBS稀释混匀。然后在室温条件下将稀释的脐血按2∶1的比例缓慢加到淋巴细胞分离液上，20℃水平离心机以2 000 r/min离心20 min，吸取乳白色的单个核细胞层至PBS中混匀，20℃水平离心机以1 000 r/min离心10 min，弃上清，然后加入适量的EGM-2完全培养基制成单个核细胞悬液。将单个核细胞接种在人纤维连接蛋白包被的六孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3 d后换液以去除未贴壁的细胞，以后每3 d进行1次换液，14 d后进行第1次传代。用第3～5代的细胞进行鉴定和后续相关实验。

1.2.2 人脐血EPCs摄取Dil-Ac-LDL及结合FITCUEA-l的鉴定 将细胞与10 μg/m l的Dil-Ac-LDL在37℃孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，再加入20 μg/ml的FITC-UEA-l，37℃孵育1 h，PBS洗2遍，最后加入DAPI染细胞核后于荧光显微镜下观察。随机取显微镜下3个视野，计算阳性率。

1.2.3 人脐血EPCs表面特异性抗原鉴定 细胞爬片后用4%多聚甲醛固定细胞20 min，依次加入20 μl阻断剂、80 μl平衡液，再将CD34、CD133和VEGFR-2抗体加到3个不同的标本中，4℃孵育过夜后用PBS洗3遍，加入FITC标记的荧光素二抗室温孵育1 h，DAPI染细胞核后于荧光显微镜下观察。随机取显微镜下3个视野，计算阳性率。

1.2.4 人脐血EPCs的体外血管生成能力 将Matrigel胶以每孔200 μl平铺于24孔板，置于37℃培养箱中孵育60 min，以使Matrigel胶聚合。将EPCs以每孔105个细胞接种于铺好Matrigel胶的24孔板，37℃培养箱中培养过夜，最后显微镜下观察血管生成情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞形态学观察

新鲜分离的单个核细胞呈圆形，形态较小（图1A)，培养第4天可见在培养孔的底面上散在有少量的圆形和梭形的贴壁细胞（图1B)，培养第8天在培养孔的底面上有细胞集落出现（图1C)，表现为边界清楚的类似圆形的单层细胞集落，开始是由几个至几十个细胞组成，随着时间的延长，形成集落的细胞增加到几百至数千个，且集落的数目也增加。第14天左右，相邻集落可相互融合，贴壁细胞呈现典型铺路石样形态（图1D)。培养过程中局部细胞首尾相接形成血管网状结构（图1E)和“线样”结构（图1F)。

2.2 人脐血EPCs摄取Ac-LDL及结合UEA-1的鉴定

在荧光显微镜下观察（图2)，分离培养的EPCs能摄取Dil-Ac-LDL（红色)和结合FITC-UEA-1（绿色)，其阳性率分别为92.4%±3.2%和95.7%± 4.3%。

2.3 人脐血EPCs表面特异性抗原鉴定

在荧光显微镜下观察（图3)，分离培养的EPCs能表达特异性抗原CD34、CD133和VEGFR-2，其表达阳性率分别为92.3%±4.1%、94.4%±6.3%和97.6%±5.2%。

图1 体外分离培养的EPCs形态

图2 EPCs摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA-l双荧光染色鉴定（×200)

2.4 人脐血EPCs的体外血管生成能力

由图4可以看出，将EPCs接种在Matrigel胶上后，细胞呈环形连接，形成较多的管腔样结构。

3 讨论

EPCs是内皮细胞的前体细胞，具有增殖、分化为内皮细胞和形成新生血管的作用。大量研究表明，EPCs参与生理性和病理性血管形成和受损内皮修复。临床研究表明，在缺血肢体或心肌中EPCs能向血管新生部位迁移，同时EPCs在肿瘤血管发生中也起重要作用［4-8］。因此，EPCs将会成为一个重要的缺血性及肿瘤性疾病的治疗靶点。

随着对EPCs的研究越来越深入，寻找一种简单的分离培养方法以获得足够多的细胞数量是科研和临床应用的主要瓶颈。从骨髓、外周血和脐带血中均可分离获得EPCs［9-11］。其中骨髓和脐血中的EPCs比外周血含量高，虽然骨髓中EPCs含量也很多，但是取材较为困难，有创伤性，并且随着供体年龄的增大，骨髓EPCs增殖分化能力显著下降，相对来说，脐血EPCs来源丰富，取材方便，无创伤性，并且增殖能力强［12］，因此脐血是获得EPCs的理想来源。

图3 人脐血EPCs表面特异性抗原CD34、CD133和VEGFR-2的表达（×200)

图4 EPCs体外血管形成实验（×50)

目前体外分离脐血EPCs的方法主要包括免疫磁珠分选、流式细胞术分选和密度梯度离心法。前两种方法虽然获得的细胞纯度较高，但是得到的细胞数量较少，操作繁琐，费用高，并且在获得较为纯化的细胞表型的同时会漏掉其他表型的细胞。例如我们以前期曾用流式细胞术从人脐血中分选CD133和CD34双阳性的单个核细胞的方法来获得EPCs［3］，最后得到的细胞数量非常少，只占所有单个核细胞的0.1%，并且实验费用较高。而本研究所用密度梯度离心法是根据血液细胞成分的密度不同，先将单个核细胞分离出来，然后用一些特定的SingleQuots细胞因子进行体外诱导分化，从而最终获得EPCs，此种方法简单、经济，并且获得的细胞数量较多且纯度较高。

本研究用特定的细胞因子对分离的脐血单个核细胞进行诱导分化后，有典型的细胞集落形成，并且在培养过程中可见首尾相接形成血管网样结构和“线样”结构，线样结构是EPCs在分化过程中的一个重要标志［13］。目前EPCs的表型鉴定尚无统一的标准，一般将同时表达CD34、CD133和VEGFR-2，并且能摄取Ac-LDL和结合UEA-l的认为是EPCs的标志［14-15］。CD34被认为是造血干细胞和造血祖细胞的特异性标志物，CD133是区别EPCs与成熟内皮细胞的主要标志，当EPCs分化为成熟内皮细胞后，CD133的表达会消失，VEGFR-2又称KDR，是内皮分化过程中较早出现的标志物，在成熟内皮细胞和EPCs的细胞膜上都有表达［16-17］。本研究获得的EPCs其Ac-LDL摄取率为92.4%±3.2%，UEA-1结合率为95.7%±4.3%，CD34、CD133和VEGFR-2表达的阳性率分别为92.3%±4.1%、94.4%±6.3%和97.6%±5.2%，获得的EPCs纯度较高，结合集落形成能力和体外血管生成能力，表明我们从人脐血中成功分离和培养出EPCs，从而可用于后续的基础或临床研究。

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In vitro isolation and cultivation of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood

Wang Yuqiang，Huang Liya，Wang Fei，Cao Qing，Sang Tiantian，Chen Shuyan.
Department of Geriatrics，Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Ob jective To establish a stable method for isolation and cultivation of endothelial progenitor cells（EPCs)from human umbilical cord blood.M ethods Mononuclear cells（MNCs)were isolated from human umbilical cord blood by density gradient centrifugation，then they were seeded in 6-well plates pre-coated with fibronectin（Fn)and cultured in EGM-2.EPCs were identified by morphology，cell surface markers，ability to uptake Ac-LDL and bind UEA-1 and in vitro tube formation characteristic. Results The morphology of freshly isolated MNCs was small and spherically shaped.A small amount of adherent cells with circular，oval and spindle shapes appeared after 4 days culture.Colonies formed after 8 days culture.The cells exhibited typical cobblestone morphology after 14 days culture.Some cells formed network structures and linear cord-like structures.EPCs could uptake Ac-LDL，bind UEA-1，express cell surface markers，CD34，CD133 and VEGFR-2，and possess in vitro tube formation ability.Conclusions EPCs can be successfully isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood and cultivated for further research.

Human umbilical cord blood； Mononuclear cells； Endothelial progenitor cells；Cell culture

Chen Shuyan，Email:shuyanchencn@hotmail.com

2014-04-28)

（本文编辑:谭潇)

This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China（No.81270205)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.05.010

国家自然科学基金面上项目（81270205)

200092上海交通大学医学院附属新华医院老年科

陈书艳，电子信箱:shuyanchencn@hotmail.com