组蛋白修饰与miRNA在小细胞肺癌中的研究进展

方淑斌，方楚玲，张 贝(综述)，郭琳琅(审校)

(南方医科大学珠江医院病理科,广州 510280)

小细胞肺癌占肺癌的10%～15%，是恶性程度最高的一种肺癌，其倍增时间短，转移早而广泛，5年生存率仅为5%[1]。越来越多的研究显示，机体自分泌循环通路、原癌基因和抑癌基因在小细胞肺癌的发生、发展中有重要的地位，而表观遗传学可通过对这三种因素的调控影响小细胞肺癌的发生、发展[2]。表观遗传是指DNA序列并不发生变化而基因表达却发生可遗传的改变,主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体修饰，广义上还包括非编码RNA等。近年来，在小细胞肺癌中对组蛋白修饰和微RNA(microRNA，miRNA)调控的研究较多，对其深入研究可为小细胞肺癌发生、发展的分子机制、临床诊断与治疗提供一个新的思路。该文就小细胞肺癌组蛋白修饰和miRNA调控的研究进展予以综述。

1 组蛋白修饰与小细胞肺癌

1.1组蛋白修饰调控小细胞肺癌的发生、发展 组蛋白是染色质的基本结构蛋白，它与DNA、非组蛋白以及少量RNA共同构成染色质。组蛋白的N端可通过共价修饰作用发生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后修饰[2]，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化是最为重要的修饰方式之一。组蛋白乙酰化是通过组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调完成的，常见于组蛋白H3的Lys9、Lys14、Lys18、Lys23和H4的Lys5、Lys8、Lys12、Lys16等位点，其可使核小体的结构变得松弛，促进转录因子和协同转录因子与DNA分子接触，从而激活特定基因的转录过程。组蛋白的乙酰化程度与转录活性密切相关:转录活动区域核心组蛋白的乙酰化密度高,而不活动区域乙酰化密度低。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂则主要通过抑制小细胞肺癌细胞系染色体的解聚，封闭DNA进而抑制小细胞肺癌的发生、发展。

1.2组蛋白脱乙酰化酶抑制剂在小细胞肺癌临床治疗中的应用

1.2.1组蛋白脱乙酰化酶抑制剂 组蛋白的乙酰化与小细胞肺癌的发生、发展有很大的相关性，Li等[3]通过分析组蛋白H4乙酰化在不同种类的肺癌中的丢失情况，发现H4乙酰化的缺失在各种肺癌中是不同的，其中在小细胞肺癌中的丢失率较高。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂则主要通过干扰组蛋白的乙酰化状态而达到治疗的目的。根据化学结构和抑制的机制，去乙酰化抑制可分为短链脂肪酸类、环氧化物、环肽、苯酰胺类、异羟肟酸类和其他化合物[4]，主要包括曲古抑菌素A、二苯基乙酸钠、异羟肟酸、丙戊酸[5]，以及一些新的组蛋白脱乙酰化酶抑制剂。它们与维持细胞内环境稳定相关的蛋白质、细胞增殖分化及细胞凋亡等密切相关。在许多关于组蛋白脱乙酰酶抑制剂的研究中，只有少部分的组蛋白脱乙酰酶抑制剂单独使用能够对小细胞肺癌细胞的分裂增殖有比较明显的抑制作用，但是大部分的组蛋白脱乙酰酶抑制剂需要和其他药物，如DNA甲基转移酶抑制剂、破坏DNA结构的药物或者拓扑异构酶-Ⅰ抑制剂等联合应用才能显示出较强的抑癌作用。尽管组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与其他药物联用对小细胞肺癌的抑制作用良好，对正常细胞毒性低，但是对于与其他药物合用时剂量搭配的调控，用药顺序的改变所产生的不同抑癌效应，以及合用后药物的作用机制等方面仍然存在着诸多不足之处，仍需要进行更深入的研究。

1.2.2组蛋白脱乙酰化酶抑制剂调控癌细胞内环境的稳定性 Otterson等[6]通过对罗咪酯肽的研究发现，尽管在初步的体外研究中罗咪酯肽对小细胞肺癌的抑制效果相当明显，但是进一步的研究发现罗咪酯肽对小细胞肺癌的作用效果不佳，Otterson等[6]在分析结果失败原因的基础上提出：将组蛋白脱乙酰酶抑制剂和其他药物治疗方法相结合以提高组蛋白脱乙酰酶抑制剂对小细胞肺癌的治疗效果，且指出组蛋白脱乙酰酶抑制剂不仅仅是作用于组蛋白的修饰，同时还可能作用于维持细胞内与内环境稳定相关的蛋白质，如微管蛋白和p53，为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用机制提供新思路。

1.2.3组蛋白脱乙酰化酶抑制剂抑制癌细胞的增殖、分裂 Luszczek等[7]通过合用DNA甲基转移酶抑制剂(5-AZA-dC)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(LBH589或MGCD0103)来研究其对小细胞肺癌的抑制作用，发现小细胞肺癌细胞系的增殖、分裂能力明显下降。进一步研究发现，两种抑制剂的协同效应使敏感性小细胞肺癌细胞系增殖能力丧失与表观遗传学的关系不大，而两种抑制剂的协同效应促进干扰素激活相关基因的表达决定了小细胞肺癌对两种药物的敏感性。Luchenko等[8]通过CalcuSyn数学模型分析的方法，研究了合用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(N-羟基-3-丙烯酰胺和罗咪酯肽)与DNA损伤药物(顺铂和依托泊苷)对小细胞肺癌细胞系增殖、分裂的影响，其通过免疫染色的方法监测磷酸化组蛋白(γ-H2AX)的变化来鉴定同时加入两种药物和先后加入两种药物时DNA的损伤程度，发现用组蛋白乙酰化酶抑制剂预处理小细胞肺癌细胞系24 h后再加入DNA损伤药物，或者在加入DNA损伤药物后再加入组蛋白乙酰化酶抑制剂，对小细胞肺癌细胞系增殖能力的抑制作用均比同时加入两种药物时减弱，其同时证明了两种药物合用后的作用机制与DNA解旋的关系不大，这对临床合理用药提供了有力的依据。此外，拓扑异构酶-Ⅰ抑制剂拓扑替康作为现今唯一用于治疗复发性小细胞肺癌的药物，在治疗血液恶性肿瘤和实体瘤(包括小细胞肺癌)有良好的临床应用前景。Bruzzese等[9]则通过研究拓扑异构酶-Ⅰ抑制剂拓扑替康与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂伏立诺他合剂对小细胞肺癌细胞系(分别为H209和H526)增殖能力的抑制作用，发现两种药物合用对两种细胞具有协同的肿瘤细胞毒性作用。此外，Kaminskyy等[10]则发现丙戊酸钠主要通过激活Notch1信号途径，从而阻碍小细胞肺癌细胞的生长、增殖。

1.2.4组蛋白脱乙酰化酶抑制剂促进癌细胞的凋亡 肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体是一种在肿瘤治疗方面很有应用前景的药物，但是许多肿瘤对其耐受，研究表明，肿瘤对该药物耐受的主要原因是细胞内胱天蛋白酶(caspase)8表达的缺乏[11]。虽然有研究已经发现DNA损伤药物阿霉素和依托泊苷可通过提高死亡受体5和降低细胞内增殖细胞核抗原抑制蛋白的表达水平,提高小细胞肺癌对肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的敏感性，但是这些传统的化疗药物不能通过提高细胞内caspase-8的表达来恢复其对肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的敏感性[12]。Luszczek等[7]则通过研究发现,DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(丙基戊酸或CI-994)相结合能够有效地恢复小细胞肺癌中caspase-8基因的表达，并且降低肿瘤凋亡抑制因子1和生存素的表达水平，从而表明DNA甲基转移酶抑制剂(地西他滨)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(2-丙基戊酸或CI-994)的结合有望成为肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体治疗低caspase-8表达小细胞肺癌的辅助剂。Crisanti等[11]研究发现，组蛋白脱乙酰酶抑制剂帕比司他(LBH589)通过调控细胞周期调节因子(如p21)和细胞凋亡相关因子(如caspase-3和caspase-7)表达的上升以及抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-x)表达的下降，能够显著抑制小细胞肺癌细胞的分裂、增殖，并且加入化疗药物依托泊苷能够增加抗癌效果，从而证明帕比司他有望成为治疗胸部恶性肿瘤，尤其是小细胞肺癌的药物之一。

2 微RNA与小细胞肺癌

2.1微RNA调控小细胞肺癌发生和发展 微RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调控功能的内源性非编码RNA，大小为20～25个核苷酸，可通过结合靶信使RNA(mRNA)中的3′非编码区，从而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译[12]。据统计，人类约有30%的基因受到miRNA的调控[13]。现已证明，位于靶基因中的3′非编码区中的单核苷酸可调控miRNA与靶基因的结合，进而调控小细胞肺癌发生、发展[14]。因此，miRNA可通过调控原癌基因和抑癌基因的表达以及参与调控细胞周期来调控肿瘤的发生、发展。

2.1.1miRNA调控原癌基因的表达 在小细胞肺癌细胞中 MYCL1(L-myelocytomatosis oncogene)和ASCL1(achaete-scute complex homolog 1)基因表达下降，Xiong等[15]检测了分别位于这两个基因的单核苷酸位点(rs3134615和rs2291854)，发现rs3134615为位于MYCL1基因3′非编码区的单核苷酸位点，has-miR-1827能够与MYCL1基因3′非编码区结合来下调MYCL1基因的表达，当位于rs3134615的单核苷酸从G变为T时，has-miR-1827与MYCL1基因3′非编码区的结合受到阻遏，导致原癌基因MYCL1表达上调，进而促进小细胞肺癌的发生、发展；而rs2291854虽为位于原癌基因ASCL1 3′非编码区的单核苷酸位点，但是其与小细胞肺癌的发生、发展关系不大。此外，有研究表明Let-7能够抑制多种原癌基因的表达，如Ras家族、HMGA2、C-myc[16]；同时其还能够抑制调节细胞周期的因子，如CDC25A[17]。Pan等[18]通过研究表明，RNA结合蛋白Lin-28能够加速Let-7前体pri-let-7a-1/7g的裂解，使小细胞肺癌细胞中的Let-7表达下降，进而促进小细胞肺癌的发生、发展，但是至于Lin-28能否抑制Let-7的转录，能否阻遏pre-let-7从细胞核转运到细胞质，则需要更多的研究。

2.1.2miRNA调控抑癌基因的表达 Du等[19]通过实验证明，miR-93、miR-98和miR-197可作用于肉瘤融合基因1的3′非编码区，调控肉瘤融合基因1蛋白的表达量，进而促进小细胞肺癌的发生、发展。此外，其还发现miR-93和miR-98在小细胞肺癌细胞中的表达量均比支气管表皮细胞和非小细胞肺癌细胞高，而miR-197在小细胞肺癌细胞和非小细胞肺癌细胞的表达量均比支气管表皮细胞低[19]。

2.1.3miRNA参与调控细胞周期 SLC7A5(Solute carrier family 7,member 5)基因是转运异质二聚体4F2氨基酸的轻链，与多种肿瘤的发生、发展均有密切的关系[20-22]。Miko等[16]通过研究miR-126表达对H69细胞增殖和细胞周期的影响发现，当H69细胞处于G1期时，miR-126能够结合其SLC7A5基因的3′非编码端，进而抑制H69细胞的增殖。

2.2miRNA在小细胞肺癌临床治疗中的应用前景

2.2.1miRNA作为小细胞肺癌诊断和预后的指标 Ranade等[23]通过检测经过化疗的小细胞肺癌样本，发现miR-92a-2*与小细胞肺癌患者的耐药和生存率的下降密切相关，而miR-92a-2*能否作为小细胞肺癌患者耐药的检测指标，则需要更多的临床试验去探索。此外，Du等[24]通过对支气管表皮细胞、小细胞肺癌细胞和非小细胞肺癌细胞中miRNA表达量的检测发现，许多miRNA(如miR-338、miR-101和miR-98等)在这三种不同的细胞中的表达量均不同，而且均在支气管表皮细胞的表达量最低，非小细胞肺癌细胞次之，小细胞肺癌细胞最多。其通过深入的分析提出：小细胞肺癌可能是由支气管表皮细胞癌变成非小细胞肺癌，然后再由非小细胞肺癌恶化形成的，因而对异常表达的miRNA进行定量可能成为小细胞肺癌诊断和预后的可靠方法[24]。

2.2.2miRNA调控小细胞肺癌的耐药过程 Guo等[25]通过miRNA微阵列芯片和DNA微阵列芯片分别检测了非耐药小细胞肺癌细胞细胞和耐药小细胞肺癌细胞中的856个miRNA和22 000个基因发现，miR-134通过结合耐药小细胞肺癌的细胞周期G1期的多耐药相关基因1，从而阻止耐药小细胞肺癌细胞的分裂，表明miRNA可调控小细胞肺癌的耐药过程，为耐药小细胞肺癌的治疗提供一个新的途径。

2.2.3miRNA调控化疗药物的细胞毒性 紫杉烷类药物是治疗肺癌的一线药物，Niu等[26]进行全基因组关联研究，将紫杉醇和多烯紫杉醇两种紫杉烷类药物作用于276个类原始淋巴细胞系，探讨单核苷酸多样性是否与紫杉烷类药物的抗癌作用相关，发现单核苷酸位点(rs2662411和rs1778335)可能通过调控hsa-miR-584和hsa-miR-1468这两种miRNA的表达，进而调控CMBL(carboxymethylenebutenolidase)和PIP4K2A(phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase,type Ⅱ,alpha)两个基因的表达，而两个基因则可能成为调控紫杉烷类药物对H196细胞系细胞毒性的位点，从而从基因水平上为小细胞肺癌患者的预后治疗提供一定的依据。

3 展 望

小细胞肺癌倍增时间短，转移早而广泛，恶性程度高，而组蛋白修饰与miRNA调控是表观遗传学修饰的重要组成部分，对其进行深入的研究可为小细胞肺癌的发生、发展及其治疗预后提供新的途径。近年来虽然对组蛋白修饰与miRNA调控进行了一定程度的研究，但是对两者的研究相对有限，仍然存在着诸多问题，如组蛋白乙酰化酶抑制剂与其他药物联用治疗小细胞肺癌的增效作用有很大的研究空间，miRNA对一些与肿瘤密切相关的mRNA靶点的调控机制仍不明确。因此，揭示组蛋白修饰与miRNA调控等在肿瘤发生、发展中的作用机制，有望在将来成为小细胞肺癌诊断及治疗的有效工具。

[1] Jackman DM,Johnson BE.Small-cell lung cancer[J].Lancet,2005,366(9494):1385-1396.

[2] Linggi BE,Brandt SJ,Sun ZW,etal.Translating the histone code into leukemia[J].J Cell Biochem,2005,96(5):938-950.

[3] Li F,Ye B,Hong L,etal.Epigenetic modifications of histone h4 in lung neuroendocrine tumors[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2011,19(5):389-394.

[4] Mariadason JM.HDACs and HDAC inhibitors in colon cancer[J].Epigenetics,2008,3(1):28-37.

[5] Platta CS,Greenblatt DY,Kunnimalaiyaan M,etal.Valproic acid induces Notch1 signaling in small cell lung cancer cells[J].J Surg Res,2008,148(1):31-37.

[6] Otterson GA,Hodgson L,Pang H,etal.Phase Ⅱ study of the histone deacetylase inhibitor Romidepsin in relapsed small cell lung cancer(Cancer and Leukemia Group B 30304)[J].J Thorac Oncol,2010,5(10):1644-1648.

[7] Luszczek W,Cheriyath V,Mekhail TM,etal.Combinations of DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibitors induce DNA damage in small cell lung cancer cells:correlation of resistance with IFN-stimulated gene expression[J].Mol Cancer Ther,2010,9(8):2309-2321.

[8] Luchenko VL,Salcido CD,Zhang Y,etal.Schedule-dependent synergy of histone deacetylase inhibitors with DNA damaging agents in small cell lung cancer[J].Cell Cycle,2011,10(18):3119-3128.

[9] Bruzzese F,Rocco M,Castelli S,etal.Synergistic antitumor effect between vorinostat and topotecan in small cell lung cancer cells is mediated by generation of reactive oxygen species and DNA damage-induced apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2009,8(11):3075-3087.

[10] Kaminskyy VO,Surova OV,Vaculova A,etal.Combined inhibition of DNA methyltransferase and histone deacetylase restores caspase-8 expression and sensitizes SCLC cells to TRAIL[J].Carcinogenesis,2011,32(10):1450-1458.

[11] Crisanti MC,Wallace AF,Kapoor V,etal.The HDAC inhibitor panobinostat (LBH589) inhibits mesothelioma and lung cancer cells in vitro and in vivo with particular efficacy for small cell lung cancer[J].Mol Cancer Ther,2009,8(8):2221-2231.

[12] Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[13] Carthew RW.Gene regulation by microRNAs[J].Curr Opin Genet Dev,2006,16(2):203-208.

[14] Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[15] Xiong F,Wu C,Chang J,etal.Genetic variation in an miRNA-1827 binding site in MYCL1 alters susceptibility to small-cell lung cancer[J].Cancer Res,2011,71(15):5175-5181.

[16] Miko E,Czimmerer Z,Csanky E,etal.Differentially expressed microRNAs in small cell lung cancer[J].Exp Lung Res,2009,35(8):646-664.

[17] Johnson CD,Esquela-Kerscher A,Stefani G,etal.The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J].Cancer Res,2007,67(16):7713-7722.

[18] Pan L,Gong Z,Zhong Z,etal.Lin-28 reactivation is required for let-7 repression and proliferation in human small cell lung cancer cells[J].Mol Cell Biochem,2011,355(1/2):257-263.

[19] Du L,Schageman JJ,Subauste MC,etal.miR-93,miR-98,and miR-197 regulate expression of tumor suppressor gene FUS1[J].Mol Cancer Res,2009,7(8):1234-1243.

[20] Kaira K,Oriuchi N,Imai H,etal.CD98expression is associated with poor prognosis in resected non-small-cell lung cancer with lymph node metastases[J].Ann Surg Oncol,2009,16(12):3473-3481.

[21] Nakanishi K,Ogata S,Matsuo H,etal.Expression of LAT1 predicts risk of progression of transitional cell carcinoma of the upper urinary tract[J].Virchows Arch,2007,451(3):681-690.

[22] Sakata T,Ferdous G,Tsuruta T,etal.L-type amino-acid transporter 1 as a novel biomarker for high-grade malignancy in prostate cancer[J].Pathol Int,2009,59(1):7-18.

[23] Ranade AR,Cherba D,Sridhar S,etal.MicroRNA 92a-2*:a biomarker predictive for chemoresistance and prognostic for survival in patients with small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol,2010,5(8):1273-1278.

[24] Du L,Schageman JJ,Irnov,etal.MicroRNA expression distinguishes SCLC from NSCLC lung tumor cells and suggests a possible pathological relationship between SCLCs and NSCLCs[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:75.

[25] Guo L,Liu Y,Bai Y,etal.Gene expression profiling of drug-resistant small cell lung cancer cells by combining microRNA and cDNA expression analysis[J].Eur J Cancer,2010,46(9):1692-1702.

[26] Niu N,Schaid DJ,Abo RP,etal.Genetic association with overall survival of taxane-treated lung cancer patients-a genome-wide association study in human lymphoblastoid cell lines followed by a clinical association study[J].BMC Cancer,2012,12:422.