生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45α在心血管疾病中的研究进展

叶雨佳(综述)，倪锐志，孟照辉(审校)

(昆明医科大学第一附属医院心内科 分子心血管病研究室，昆明 650032)

生长阻滞和DNA损伤诱导基因(growth arrest and DNA damage-inducible,GADD)45家族由GADD45α、GADD45β、GADD45γ组成，家族成员分别编码GADD45α、GADD45β和GADD45γ蛋白质，其分子质量小(18.3×103)、进化保守(真核生物间有55%～57%氨基酸序列相同)、高度酸性(pH=4.0～4.2)、主要分布于细胞核内[1]。GADD45与涉及细胞凋亡、细胞周期调控、DNA损伤修复等功能的生物大分子相互作用，在细胞增殖、衰老、凋亡等生理过程中发挥重要的调控作用。

1 GADD45α基因及蛋白质特征

GADD45α又称为DNA损伤诱导基因，是抑癌基因p53和乳腺癌易患基因1的下游靶基因，1988年由Fornace等[2]使用消减杂交筛选的方法，从紫外线照射后的中国仓鼠卵巢细胞中克隆出GADD45α的互补DNA序列。人GADD45α位于1p31.2～p31.1，全长3278 bp，含4个外显子，信使RNA全长1355 bp,编码序列全长498 bp。GADD45α编码的蛋白质是核糖体蛋白L7Ae家族中的一员，是核糖核蛋白颗粒的一个组成部分[3]。GADD45α由165个氨基酸组成，等电点4.36，相对分子质量18.3×103，主要分布于细胞核，也可以在胞质中出现[4-5]。

2 GADD45α的表达与调控

GADD45α在多种损伤因素，如紫外线照射、电离辐射、甲基甲磺酸、烷化剂、营养缺失、二甲基苯蒽、化疗药物等作用下表达迅速上调，其诱导表达受到多个层次的精确调节。①转录水平：p53结合于GADD45α的第三个内含子中的p53基序上，直接促进GADD45α的转录表达[6]；核转录因子Wilms瘤基因1(Wilms′tumor gene 1，WT1)与GADD45α启动子上的WT1基序结合，p53通过与WT1的相互作用间接调控GADD45α的转录[7]。转录因子乳腺癌易患基因1、有机阳离子转运体1、核因子FA(nuclear factor-YA，NF-YA)等也可与GADD45α的启动子区域结合，通过p53非依赖的方式调节其转录[8]。②转录后水平：甲基甲磺酸可以解离结合于GADD45α的3′非编码区的不均一RNA核糖核蛋白D和T细胞凋亡抑制相关蛋白，从而提高GADD45α信使RNA的稳定性[9]。③翻译水平：GADD45α的表达与其信使RNA 5′非编码区内特殊序列介导的非戴帽机制相关[10]。④翻译后水平：砷可以抑制小鼠胚胎成纤维细胞核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)介导的泛素化蛋白酶降解GADD45α，从而提高GADD45α的表达[11]。

3 GADD45α的生物学作用

GADD45Α参与调控基因组的稳定性、细胞周期行进、DNA修复、细胞凋亡等多种生物学过程。GADD45α与Aurora-A激酶相互作用，有效抑制Aurora-A激酶介导的中心体扩增，从而维持基因组的稳定性[12]。GADD45α的中心区域(Asp65～Glu84)可介导周期蛋白依赖性蛋白激酶2/周期蛋白B1复合物解聚，导致细胞丧失周期蛋白依赖性蛋白激酶的活性，细胞被阻滞在G2/M期[13]。近期研究发现，GADD45α可通过活化的c-Jun氨基端激酶，使细胞阻滞在G2/M及G1期[14-15]。c-Jun氨基端激酶作为GADD45α介导凋亡反应的主要下游靶分子，可在转录因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)作用下激活后活化胱天蛋白酶3依赖的凋亡调节通路[16]。GADD45α可通过调控β联蛋白/上皮钙黏素复合物的稳定性及下调基质金属蛋白酶9的表达抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[17]。

GADD45α不仅可与增殖细胞核抗原、p21结合调节DNA损伤修复，近期研究发现，还可以启动DNA主动去甲基化，调节DNA切除修复。肿瘤源性黏附因子12作用下，GADD45α聚集于核糖体DNA的启动子上并除去核糖体DNA启动子上甲基化的胸腺嘧啶，促进DNA核苷酸切除修复[18]。GADD45α与活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶及胸腺嘧啶糖苷酶结合，调节DNA碱基切除修复[19-20]。GADD45α也可与GADD45β、GADD45γ或自身重组形成寡聚体，共同调节GADD45介导的多种损伤因素刺激引起的DNA损伤修复、细胞凋亡等生物学过程。

4 GADD45α与心血管疾病

4.1GADD45α与心室重构

4.1.1GADD45α与心肌梗死后的心室重构 缺血缺氧时心肌细胞内活性氧自由基蓄积所致的氧化损伤是心肌损伤的重要原因。心肌细胞氧化损伤可致心肌细胞死亡，继而发生心肌纤维化、肥大，心室腔扩大，心功能下降，最终导致心力衰竭。Edwards等[21]将小鼠按照年龄大小分为5个月、15个月、25个月组，在每组小鼠腹腔内注射一定量的剧毒药物百草枯，使机体产生大量的氧自由基，百草枯及氧自由基随血液流动，到达心肌细胞内，对心肌细胞产生不同程度的破坏，从而建立氧化应激模型，使用基因芯片技术检测百草枯注射后不同时间小鼠心肌细胞内基因表达情况，结果显示5个月的幼年小鼠在注射百草枯3 h后，GADD45α及丝裂原活化蛋白激酶6等介导DNA损伤修复的基因表达水平显著上调。作为forkhead转录因子家族(forkhead transcription factor O family，FOXO)介导的DNA修复的下游靶分子，GADD45α可与FOXO3a共同调控心肌细胞DNA的损伤修复[22]。Sengupta等[23]将实验大鼠的冠状动脉左前降支结扎，制作心肌梗死模型，采用基因敲除、定量反转录聚合酶链反应、蛋白质印迹及组织学分析等方法研究FOXO转录因子促进氧化应激损伤后心肌细胞存活的机制，结果显示与未剔除FOXO1和FOXO3的心肌细胞相比，基因敲除的大鼠心肌细胞梗死面积扩大，心肌纤维化程度增加，DNA损伤修复蛋白GADD45α与具有抗氧化作用的过氧化氢酶、锰超氧化物歧化酶在基因及蛋白质水平表达均显著下调。这些研究表明，GADD45α在调节氧化应激刺激下的心肌细胞DNA修复过程中发挥一定的作用。

4.1.2GADD45α与高血压左心室肥厚 高血压左心室肥厚是指由于高血压导致左心室重量增加,病理表现为心室壁的增厚及心肌重量的增加和以心肌细胞肥大、心肌纤维化为主的心室重构，是冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、猝死、脑卒中等事件的独立危险因素。Rysä等[24]将实验大鼠分为三组，其中两组为实验组，分别注射精氨酸加压素或血管紧张素Ⅱ，第三组为对照组注射生理盐水；使实验组大鼠血压升高至160 mm Hg，通过基因芯片技术检测大鼠左心室心肌细胞内基因的表达情况，结果显示精氨酸加压素、血管紧张素Ⅱ均可使DNA损伤修复基因GADD45α及凋亡相关蛋白Bcl-x表达上调。使用血管紧张素受体1拮抗剂氯沙坦阻断血管紧张素Ⅱ作用6 h后，使用蛋白质印迹方法检测GADD45α及Bcl-x的表达情况，结果显示Bcl-x的表达量较之前下降了40%，而GADD45α则下降至阴性对照组水平。González等[25]选取冠状动脉造影正常的28例原发性高血压患者作为试验组，8例尸检正常的心肌组织作为对照组，将试验组随机分为两组，分别使用氯沙坦、氨氯地平降压治疗1年，治疗前、后使用经静脉心内膜心肌活检技术取患者心脏室间隔中部心肌组织，采用末端转移酶标记技术检测心肌细胞凋亡水平，发现原发性高血压患者心肌细胞凋亡指数较正常心肌组织显著升高，降压治疗后，氯沙坦治疗组心肌细胞凋亡指数较治疗前显著下降，而氨氯地平治疗组的心肌细胞凋亡指数较治疗前无明显变化。由此推断，GADD45α可能在血管紧张素Ⅱ介导的压力超负荷引起的左室心肌肥厚中发挥重要的作用。

4.2GADD45α与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化发病机制复杂且严重危害人类健康。在长期的高脂血症情况下，增高的氧化低密度脂蛋白通过特异性内皮细胞表面的植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1介导的内皮毒性对动脉内膜造成功能性损伤，被认为是动脉粥样硬化的危险因素。Thum等[26]用蛋白质印迹、半定量反转录聚合酶链反应法发现植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1、GADD45α在主动脉粥样硬化组织中表达明显上调，对相关机制研究发现，人主动脉内皮细胞受氧化低密度脂蛋白刺激致氧化DNA损伤时，有机阳离子转运体1、GADD45α的表达显著增高，导致冠状动脉内皮细胞代谢异常。由此推断，GADD45α可能在氧化低密度脂蛋白引起的内皮损伤中发挥一定的作用。

Dancu等[27]报道了血流动力学的改变会影响内皮细胞功能，可能与动脉粥样硬化形成有关。在人体内动脉粥样硬化最显著的地方，如冠状动脉和颈内动脉分支外侧壁，流体对血管壁的剪应力相对较低，流体剪应力与固体牵张力最不同步[28]。Lin等[29]将牛主动脉内皮细胞置于不同剪应力的层流中剪切，用免疫共沉淀、蛋白质印迹、荧光素酶报告基因法、RNA干扰、基因突变等研究层流剪应力影响内皮细胞生长的机制，结果显示当牛主动脉内皮细胞在剪应力为1.2 N/m2的层流中剪切30 min后便发现p53磷酸化，24 h后GADD45α及周期蛋白依赖激酶抑制因子p21Cip1的表达显著升高，最终细胞周期依赖性激酶活性及视网膜母细胞瘤基因磷酸化作用受抑，从而抑制细胞增殖。使用RNA干扰抑制p53转录活性、突变WT1位点可以有效抑制层流剪切应力诱导的GADD45α启动子的活性。这些研究表明，在持续的高层流剪切力作用下，GADD45α以p53依赖的方式表达上调，并可能在调控细胞周期行进、加强DNA修复及避免细胞大量增殖及凋亡中发挥重要的作用。

4.3GADD45α与心脏瓣膜病 心脏瓣膜病是多种原因引起的单个或多个瓣膜结构的功能或结构异常。胚胎时期，心脏瓣膜的发育异常与心脏瓣膜病密切相关。碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(basic helix-loop-helix transcription factor 1，TWIST1)在胚胎时期瓣膜发育过程中发挥着重要作用[30]。Lee等[31]采用染色体免疫共沉淀、原位杂交、RNA干扰等技术研究正常小鼠胚胎瓣膜中基因的表达及作用机制，发现GADD45α是TWIST1的靶基因，其内含有保守的E-box序列，TWIST1结合在这一区域与GADD45α发挥调节心脏瓣膜间质细胞的增殖与迁移、细胞外基质的合成等作用。

5 结语与展望

在多种损伤因素刺激下，GADD45α参与许多疾病的发生、发展，并与多种生物大分子相互作用形成一个关系紧密而复杂的网络，例如与Aurora-A、周期蛋白依赖性蛋白激酶2/周期蛋白B1、增殖细胞核抗原、p21、c-Jun氨基端激酶及GADD45β、GADD45γ相互作用，在维持基因组的稳定性、调节细胞周期行进、DNA修复、细胞凋亡等生物学过程中发挥重要的功能。阐明GADD45α的功能及其在疾病中的作用机制，有助于为多种疾病建立更加有效的诊断方法及更安全的治疗方案提供思路和途径。但GADD45α具有多样的生物学功能，明确具体作用机制仍需进一步研究。

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