MicroRNA-33在动脉粥样硬化中的研究进展

鄢梦竹(综述)，李书国(审校)

(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院老年病科，湖北 宜昌 443002)

近年来，微RNA(microRNA，miRNA)倍受关注。自1993年在线虫细胞发现后，科学家们发现在动物、植物以及病毒体内存在大量的miRNA[1-2]。研究显示，miRNA在心血管系统中高度表达，尤其在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中起重要的作用[1]。研究表明，参与AS脂质代谢的miRNA,包括miR-122、miR-370、miR-378/378*、miR-335、miR-27、miR-125a-5p和miR-33等[3]。该文就近年来报道的miR-33在AS发生和发展中对胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和脂肪酸代谢的影响及其调控机制进行综述，期望推动miRNA在脂质代谢紊乱方面的机制研究，能够对AS的治疗有一定的帮助。

1 miRNA的形成及作用机制

miRNA是一组内源性的、高度保守的、大小约为22个碱基的非编码RNA分子，参与体内多种生物过程。其通过与靶基因mRNA的3′-非编码区(untranslated region，UTR)结合在转录后水平直接降解靶标mRNA或抑制蛋白质翻译。

1.1miRNA的形成 miRNA基因最初由RNA聚合酶Ⅱ转录形成具有5′帽子结构和3′polyA的初级miRNA(pri-miRNA)，接着在细胞核中经聚合酶ⅢDrosha和DGCR8组成的蛋白复合体作用，加工处理成大小为70～100 nt、具有茎环结构的次级转录产物(pre-miRNA)。然后pre-miRNA经转运蛋白Exportin-5运送到细胞质中，由核酸酶Dicer切割，形成长约22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA与RNA诱导的沉默复合物结合，从而发挥转录后翻译水平的调节作用[4-5]。

1.2miRNA的作用机制 miRNA与其靶基因mRNA的作用机制有两种：当miRNA与靶基因mRNA的 3′UTR端不完全互补结合时，其在蛋白质水平抑制目的基因的表达，阻遏翻译但不影响mRNA的稳定性；而当miRNA与某段目的基因序列完全配对时，主要引起目的基因断裂，最终在mRNA水平导致基因沉默[4]。

2 miR-33在AS中的研究

胆固醇和脂肪酸参与AS的发生、发展已经得到公认[6-8]。miR-33被证明在转录后水平抑制参与细胞胆固醇流出和HDL代谢基因，如腺苷三磷酸结合盒转运体(ATP binding cassette transporter，ABC)A1、ABCG1、C型1类尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein，NPC1)，以及脂肪酸氧化基因，如肉碱O-辛基转移酶(carnitine O-octanoyltransferase，CROT)、肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A)、羟烷基辅酶A 脱氢酶B/3-酮乙基-辅酶A硫解酶/烯酰辅酶A水合酶β亚单位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzy-me A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase β-subunit，HADHB)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等的表达[7,9]。因此，可以通过抑制miR-33的表达来解除其对以上基因的抑制，达到防止AS发生及促进其转归的目的。

2.1miR-33调节体内胆固醇平衡 胆固醇是细胞膜的基本组成成分，在细胞的生物学功能方面起着重要作用。血浆胆固醇过剩导致其在动脉壁聚集，从而引起AS的发生、发展[7,10]。如果能有效地调节胆固醇合成、摄取以及排除，将对治疗AS非常有利。目前已知调控体内胆固醇平衡的经典转录因子包括胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)和肝X受体。其中SREBP通过结合到增强子区域来活化参与胆固醇和脂肪酸生物合成及摄取基因的转录，最终产生三酰甘油和磷脂，SREBP主要有三种亚型：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2[8]。除了SREBP，肝X受体也参与体内胆固醇和脂肪酸的调控。当胆固醇水平升高时，肝X受体发生活化，诱导参与胆固醇吸收、转运和排泄蛋白的表达，参与该过程的因子包括ABCA1、ABCG1、ABCG5/G8和载脂蛋白E[7]。

最近研究表明，新发现的miR-33也参与体内胆固醇平衡的调节[4]。通过与其宿主基因SREBP一起调节胆固醇/脂质平衡[11-14]。在人体中存在两种miR-33基因：miR-33b位于第17号染色体SREBP-1基因的17号内含子区域，其宿主基因可选择性调控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a位于第22号染色体SREBP-2基因的16号内含子区域，其宿主基因控制着细胞内的胆固醇合成和摄取；然而，在小鼠体内只有miR-33a基因的表达位于SREBP-2基因的15号内含子区域[14-15]。鉴于miR-33b序列只在大型哺乳动物中表达，因此强调了miR-33a在种属间进化的高度保守性[1,8,16]。虽然miR-33a/b成熟形式只相差2个核苷酸，但它们与靶基因mRNA 3′-UTR的结合位点,即“种子序列”相同,因此有可能抑制相同基因的表达[13,17-18]。在胆固醇平衡的调节中，miR-33通过靶向ABCA1、ABCG1和NPC1发挥作用[8,11,19]。脊椎动物中作用最突出的是ABCA1，它是HDL的生物合成和胆固醇逆向转运的重要调控者[14,16]。

在肝脏，ABCA1可以使额外的胆固醇从细胞流出到载脂蛋白A-I形成初生型HDL；在外周组织特别是AS损伤处的巨噬细胞中，ABCA1又介导胞内胆固醇流出到初生型HDL，再传递到肝脏分解成胆汁酸来代谢,这个过程被称为“胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)”，其在体内胆固醇的平衡中发挥着重要作用，也是重要的抗AS机制。在各种细胞类型中，尤其是肝细胞，miR-33过表达可下调ABCA1蛋白质的表达，减少胆固醇流向载脂蛋白A1和初生型HDL的产生，进而抑制RCT[5,12]；相反，抑制miR-33的表达可增加肝脏ABCA1蛋白质的表达，从而增强RCT。这一结果表明，抑制miR-33的表达可阻止AS的发生、发展[16,20]。有研究显示，来源于miR-33不足的小鼠腹膜巨噬细胞ABCA1水平显著增加，具有更多载脂蛋白A-I依赖的胆固醇流出，肝脏ABCA1蛋白水平也更高，表明miR-33在调节ABCA1表达和胆固醇流出中起着极其重要的作用，因此可以通过适当下调miR-33水平来达到治疗相关疾病的目的[21]。也有研究报道，在小鼠体内通过反义寡核苷酸技术、病毒传递性发夹抑制剂沉默miR-33a，或有针对性地剔除miR-33a,可以增加肝脏ABCA1水平和循环HDL水平，其最高可达40%[12-13,22]。另一份报道显示，使用慢病毒过表达反义miR-33，6 d后肝脏ABCA1蛋白水平增加50%，伴随血浆HDL水平增加25%[21]。Marquart等[23]也表示，体内注入反义miR-33寡核苷酸可导致ABCA1表达和HDL水平大幅提升。miR-33靶向ABCA1与SREBP协同调控胆固醇平衡，使miR-33有望成为治疗并改善AS的新疗法。

除了ABCA1，研究人员还发现另外两种参与胆固醇动员的miR-33靶基因：ABCG1和NPC1，ABCG1促进胆固醇外排到高密度脂蛋白，NPC1将胆固醇从溶酶体运输到细胞内其他部位，以便进行下一步转运[11-12]。小鼠ABCG1基因的3′UTR包含两个miR-33结合位点，而人类基因3′UTR不存在这些位点，在小鼠巨噬细胞过表达miR-33时可抑制ABCG1蛋白的表达，而在人类却不出现类似的情况，表明该基因由miR-33的种属特异性调控[12,19]。Rayner等[13]报道，在抗miR-33 4周的低密度脂蛋白受体基因剔除(LDLR-/-)小鼠肝脏中ABCG1的蛋白水平增加。然而其他研究表明，小鼠体内的miR-33的消耗并没有改变肝脏中ABCG1蛋白的水平，表明miR-33调节ABCG1可能取决于动物模型的遗传背景[11]。人类NPC1的3′UTR包含两个miR-33结合位点,导致NPC1蛋白表达被人类巨噬细胞和肝细胞中的miR-33抑制。NPC1还能够与ABCA1协同作用促进细胞内胆固醇流向载脂蛋白A1，表明miR-33对人的胞内胆固醇外排功能进行了双重抑制[12]。小鼠NPC1基因的3′UTR只有1个miR-33结合位点，但是不会被miR-33抑制。总而言之，miR-33通过特异性靶向ABCA1、ABCG1和NPC1 3′UTR来调控体内胆固醇平衡，而其他不含miR-33靶点的脂质相关基因的表达并没有明显改变。在其他包含假定miR-33结合位点的基因，如3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因和胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白基因也只是轻度下调，而在mRNA和蛋白表达水平并没有改变[19]。

miR-33在胆固醇调节中起到了不可或缺的作用，其通过胞内胆固醇出发的负反馈环来发挥功能，当胆固醇含量不足时，miR-33和胆固醇调节元件结合因子2同时转录共同调节胆固醇平衡，通过同时开始胆固醇摄取和合成路径，抑制胆固醇流出；而当胞内胆固醇过量时，miR-33又可以通过ABCA1途径促进胆固醇流出。所以，体内miR-33的异常表达可引起一系列代谢性疾病，尤其是AS。

2.2miR-33调节HDL-C的生物合成 血浆HDL-C水平与心血管疾病有很强的负性关系，因此，升高HDL-C水平的治疗成为研究的焦点。通过Framingham心脏研究表明，每增加1%循环HDL-C，发展为冠状动脉粥样硬化性心脏病危险可减少2%[24]。ABCA1除了参与细胞内胆固醇的转运，还参与肝脏HDL-C的形成，提示miR-33对血浆HDL-C水平的调控具有重要意义。研究发现，miR-33通过抑制ABCA1的表达，可以降低血浆HDL水平，拮抗内源性miR-33表达后，小鼠血浆HDL水平明显升高，同时减少了斑块大小、脂质成分以及炎症基因的表达，增加了斑块的稳定性[16,22]。Rayner等[24]在LDLR-/-的小鼠AS模型进行为期4周的抗miRNA寡核苷酸治疗，结果显示，HDL-C水平有效升高，斑块巨噬细胞和脂质成分减少35%，胶原成分增加2倍，提高了病变的改造和斑块的稳定性，促进AS斑块转归。Marquart等[25]报道，miR-33的腺病毒转导引使HDL-C水平减少了29%，相反，在miR-33a-/-小鼠中，巨噬细胞和肝细胞ABCA1的表达水平均升高，并增加了基线HDL水平。Najafi-Shoushtari等[14]在高脂饮食的小鼠模型中，利用锁定miR-33a的特定核苷酸处理动物后，发现血浆HDL-C水平上调约35%。另外，除了靶向肝脏，Rayner等[24]研究表明，2′氟代/甲氧乙基-修饰的硫代硫酸主链反义寡核苷酸注射可以渗透AS斑块到达病变的巨噬细胞中，从而上调ABCA1的表达，增强胆固醇从泡沫细胞排除。因此，抗miR-33功能不仅升高HDL和促进RCT，也直接靶向调节斑块中的巨噬细胞，通过上调细胞胆固醇流出路径来进一步增强RCT，在巨噬细胞中抑制miR-33可能也会有利于阻止斑块破裂。抗miR-33治疗升高血浆HDL的结果也在非人类灵长动物中被证实[19]。

有研究显示，在LDLR-/-的小鼠体内注射抗miR-33寡核苷酸(每周1次，共14周)，血浆样本分析显示，在处理最初2周内HDL-C升高，但没有持续到实验末尾[17]。在抗miR-33处理的小鼠中，与对照组相比循环三酰甘油的水平显著增加，最后检查发现斑块的大小和成分并没有重大改变，表明在LDLR-/-小鼠体内长期沉默miR-33不能维持血浆HDL-C水平的升高，即不能阻止AS的发生、进展[25]。

抗miR-33可通过反义抑制剂或剔除等方法来升高循环HDL-C水平，增强巨噬细胞胆固醇的流出和RCT，这些均表明靶向反义寡核苷酸的miR-33可能作为减少AS的新型治疗策略。

2.3miR-33的调节脂肪酸代谢 miRNA除了可以调节胆固醇的平衡和HDL-C的生物合成外，还可直接调节与脂肪酸氧化相关蛋白的表达。miR-33减少参与脂肪酸氧化基因的表达，如CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα等；同时还增加参与脂肪酸合成基因的表达，如胆固醇调节元件结合因子1、脂肪酸合成酶、ATP枸橼酸盐裂解酶和乙酰-辅酶A羧化酶等。CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα都含有功能性的miR-33a/b结合位点。CROT是一种过氧化物酶体的酶，催化短链脂肪酸向肉碱转移，使它们可通过β-氧化降解，促进脂肪酸从过氧化物酶体运输到细胞质[11]。CPT1A是β-氧化的限速酶，是必需的乙酰辅酶A的耦合肉碱，使长链脂肪酸运输到线粒体进行β氧化。HADHB可催化线粒体对长链脂肪酸β-氧化的最后三个步骤，而AMPKα刺激肝的脂肪酸氧化和生酮作用[11]。研究发现，当肝细胞过表达miR-33时，CPT1A和HADHB的表达水平降低，衰减脂肪酸β氧化，大大减少脂肪酸降解，导致中性脂质的聚集；相反，内源性抑制miR-33的表达可增加脂肪酸的降解[8,10]。Rayner等[13]研究表明，在用反义miR-33寡核苷酸处理的非人类灵长动物中，血浆极低密度脂蛋白的水平显著降低。这些研究均表明，抗miR-33的治疗可能是一种很有前景的策略，以提高血浆HDL和降低极低密度脂蛋白三酰甘油的水平，从而达到治疗高脂血症和AS的目的。

3 展 望

miR-33通过参与脂质代谢在AS的发生、发展中起重要作用。基于这一点，可以通过抑制miR-33的表达，促进胆固醇反转运、增加循环HDL-C，使抗miR-33作为新型治疗AS和心血管疾病的有效方式。因此，有效沉默miR-33和(或)他汀类药物的联合应用对提高HDL和降低低密度脂蛋白的水平可能是治疗AS的新策略。虽然miR-33可作为潜在的药物治疗靶向，但仍面临着许多挑战，如单一的miR-33如何在体内外严格调控多目标基因的表达，共转染不同的miRNA在单个靶基因的表达会产生哪些影响；还存在哪些更多的miR-33靶点，其调控机制如何；拮抗miR-33是否对其他组织器官产生一些不利影响；有效合成的治疗性miR-33能否被安全传送到特定的靶组织，是否会产生一定的不良反应，这些问题都有待于进一步的研究和不断的探索。

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