Fas信号通路通过诱导EMT促进胃癌细胞的侵袭转移

石萌 南兴建 李文静 王亚东 郑浩轩

Fas信号通路通过诱导EMT促进胃癌细胞的侵袭转移

石萌1南兴建2李文静1王亚东1郑浩轩1

目的探讨Fas信号通路促进胃癌细胞侵袭转移的可能相关机制。方法以低浓度FasL处理胃癌细胞株AGS，免疫印迹及ELISA检测上皮间质转化（epithelial-mesenehymal transition,EMT）的分子生物学标记改变；稳定沉默Snail及Twist转录因子，transwell小室侵袭实验检测FasL处理后胃癌细胞的侵袭能力；免疫印迹检测信号通路激活状态及相应的抑制效应。结果FasL可以诱导AGS细胞株出现EMT表型，并可促进胃癌细胞的侵袭转移能力。同时该过程中出现ERK1/2信号通路的激活，而抑制ERK1/2信号通路，可以抑制FasL诱导EMT及提高肿瘤侵袭能力的作用。胃癌组织中相应分子生物学标记的表达变化符合EMT的发生。结论Fas信号通路能够激活ERK1/2通路诱导EMT的发生，并且能通过该机制增强胃癌细胞AGS的活动能力。

Fas信号通路；EMT；ERK1/2信号通路

Fas又称Apo-1或CD95分子，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族成员。FasL是其天然配体，在体内主要以膜结合形式存在，Fas/FasL结合是激活体内Fas凋亡信号的有效途径。最近研究显示，Fas信号通路除了能够诱导细胞凋亡，也可以导致非凋亡事件[1]，如调节肿瘤的生长和运动[2]，但是其具体的机制尚未明确。

上皮间质转化（epithelial-mesenehymal transi－tion,EMT）在胚胎发育、组织发生中起重要作用，并存在于多种慢性疾病的发病过程及肿瘤的浸润转移过程中。当肿瘤细胞发生转移时，正常上皮细胞发生EMT，进而形成局部扩散，细胞侵入淋巴管和血管发生转移[3-4]。EMT以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征。在此过程中伴有多个细胞分子标志改变：上皮细胞标志物如E钙粘蛋白（E-cadherin）表达下调，间质细胞转录因子如Snail，Twist表达上调，对诱导EMT有辅助作用的基质金属蛋白酶MMPs表达上调[5]等。在本研究中，我们将探讨Fas信号通路是否可以通过诱导EMT提高胃癌肿瘤细胞的运动能力及其可能激活的相关通路。

材料与方法

一、材料

人胃癌细胞株AGS，来自美国菌种保藏中心；RPMI 1640培养基，胎牛血清，谷氨酸，青霉素，链霉素，PBS，牛血清白蛋白，EDTA胰酶；FasL购自Alexis公司；抗FasL抗体和shRNA慢病毒载体购自Santa Cruz公司；胃癌患者病变部位病理组织样品来自南方医院；EMT相关蛋白抗体购自BD公司；基质金属蛋白酶抑制剂，Transwell小室购自Corning公司。

二、方法

1.细胞培养

人胃癌细胞株AGS用含10%小牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，加入100 IU/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内常规培养。进行实验前将含10%FBS的培养基换为无血清培养基过夜。FasL的实验浓度为12.5 ng/ mL。

2.免疫印迹

取对数生长期AGS细胞，裂解，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，以各泳道30 μg的总蛋白量进行10%SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜、封闭，一抗（1:1 000）室温孵育滤膜1 h，PBST洗膜，HRP标记的二抗（1:5 000）室温孵育滤膜1 h，洗膜后进行ECL化学发光、X光片曝光并显影、定影，分析结果。

3.酶联免疫吸附试验

细胞培养上清中MMP9和MMP2的分泌根据人Quantikine酶联免疫试剂盒说明书进行检测，设定对照组平均表达MMPs为基准（1倍），以公式（变化倍数=治疗组表达÷对照组表达）表示结果。

4.细胞系转染

胃癌细胞株AGS中稳定转染沉默人Fas蛋白的shRNA慢病毒载体，加入FasL处理。具体步骤按照试剂盒说明书操作。

5.Transwell小室侵袭实验

Transwell小室上室加入无血清培养基（100 μL）于37℃水化30 min，吸去上室培养基，加入含50 000个细胞的无血清培养基细胞悬液（24小时前无血清饥饿），下室加入10%胎牛血清的培养基（500 μL），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养。72 h后，用棉签拭子擦去吸附在膜顶端的细胞，用4%多聚甲醛固定穿过并吸附在膜底端的细胞，DAPI染液染色。置于显微镜下观察并拍照，随机选取4个低倍视野（×100）进行细胞计数，并计算平均值。实验重复2次。

三、统计分析

进行统计分析，采用SPSS 17.0。单向方差分析（ANOVA）评估组间差异，最显着的差异（LSD）用于多重比较。P值小于0.05被认为有统计学意义。

结果

一、Fas信号通路诱导的上皮间质转换（EMT）

为了探讨Fas信号通路是否可以诱发EMT，我们用免疫印迹的方法检测Fas激活后胃癌细胞EMT标志物的表达。实验结果显示，在胃癌细胞AGS中，Fas信号通路的激活，会抑制上皮标记蛋白（E-cadherin，Occludin）的表达，同时提高了间质标记蛋白（Vimentin和Snail）的表达（图1A）。加入FasL处理后，细胞培养上清的ELISA实验数据显示，基质金属蛋白酶的表达（MMP9和MMP2）较空白对照组显著增加（图1B）。以上实验结果表明，Fas信号通路激活，可以诱发胃癌肿瘤细胞AGS发生EMT。

二、FasL通过诱导EMT促进胃癌细胞活动能力

在AGS细胞中，分别用慢病毒shRNA沉默Snail和Twist蛋白。免疫印迹结果显示，Snail蛋白（图2A）和Twist蛋白（图2B）的表达被稳定沉默，同时给予FasL处理后两者表达无明显提高。侵袭实验结果表明，FasL处理可以提高AGS细胞株的侵袭能力。同时在FasL处理组中，沉默Snail或Twist蛋白后的AGS细胞株侵袭能力，显著低于转染空载体的AGS细胞株。但是沉默Snail或Twist蛋白后的AGS细胞株中，FasL处理仍可以提高其侵袭能力（图2C，2D）。上述结果提示，Fas信号通路诱导的EMT过程，可能通过调控不同的转录因子增加胃癌肿瘤细胞的侵袭能力。

图1 Fas信号诱导胃癌肿瘤细胞发生EMT

图2 Fas信号通路诱导EMT促进胃癌细胞侵袭转移能力

三、Fas信号通路通过激活ERK1/2通路诱导EMT产生

用免疫印迹检测在经过FasL处理后的胃癌肿瘤细胞中，是否存在相关的通路[2,6-7]激活。结果显示，在FasL处理后的AGS细胞中，发生了ERK1/2通路的激活（图3A）。用ERK1/2通路的抑制剂U0126（10 μM）对肿瘤细胞进行预处理，免疫印迹检测EMT分子生物学标记表达，结果提示FasL处理不能够诱导EMT的产生（图3B）；transwell小室实验检测细胞侵袭能力，结果提示抑制ERK1/2通路的激活，可以抑制FasL对肿瘤细胞侵袭能力的提高（图3C）。上述实验结果提示，Fas信号通路诱导胃癌细胞EMT发生和促进其侵袭作用的过程，依赖于ERK1/2通路的激活。

四、FasL及EMT分子生物学标记在胃癌组织中的表达变化

对15例胃癌患者组织学样本，按照胃癌是否出现转移分为未转移胃癌组（GC）和转移胃癌组（MGC），免疫印迹检测其中FasL、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况。实验结果显示，与未转移组比较，转移组胃癌的FasL和Vimentin蛋白表达水平较高，相应E-cadherin蛋白表达水平较低（图4）。结果提示，在组织学水平上，亦能够证实Fas诱导的EMT的发生。

图3 Fas信号通过激活ERK1/2通路诱导EMT

讨论

图4 胃癌组织中EMT分子表达改变

Fas信号通路除了能够诱导细胞凋亡，也可以诱导非凋亡事件，如调节肿瘤的生长和运动。据报道，低剂量FasL可以诱导细胞发生非凋亡事件，如在胃癌细胞和大鼠胃黏膜细胞中可以促进增殖[8-9]。然而，在凋亡细胞和抗化疗药物细胞中，高剂量的FasL也能够提高活动能力。Fas信号通路能增强细胞活动能力，导致胃肠道肿瘤的转移，但是具体机制仍是未知数。在本研究中，我们的目的即是探讨Fas信号通路提高胃癌肿瘤细胞运动能力可能的相关机制。虽然存在争议，但是EMT和MET模型是一个解释实体肿瘤如何从原发灶扩散到转移灶很好的方法[4]。本实验中，我们用低剂量的FasL处理胃癌细胞株AGS，通过对EMT分子生物学标记蛋白E-cadherin，Occludin和Vimentin表达改变的检测，我们发现Fas信号通路能够通过诱导蛋白表达量发生改变，上皮性的标记随着时间的推移减少，相应间质性的标记则增加，并且这种变化是Fas依赖性的，需要FasL持续刺激产生。这些数据表明，Fas信号确实能够诱导EMT发生，以增加肿瘤细胞在体外的活动能力。

某些转录因子，如Snail蛋白和Twist蛋白，在Fas诱导EMT时发挥了重要作用[10]。在此，我们注意到，Fas信号通路不仅通过调控同一个转录因子诱导EMT，而是通过调控至少两种转录因子诱导EMT发生并增强肿瘤细胞活动能力。这种模式与TGF-β诱导的EMT过程类似[11]。

在肿瘤细胞中，Fas的刺激可能激活各种细胞信号通路，如NFκB[2]，MAPK[1-2,6]，和PI3K/Akt[7]而诱导非凋亡事件。在本项研究中，胃癌细胞株AGS经过FasL处理后出现了ERK1/2通路的激活。文献报道，肝细胞生长因子，血管内皮生长因子和表皮生长因子诱导的酪氨酸激酶介导的EMT中，RAS-Raf-MAPK信号通路的激活起到了重要的作用；PI3K/ Akt信号通路的激活在肝癌细胞中可以控制缺氧诱导的EMT[12]，在抗凋亡的胶质瘤细胞中促进Fas信号通路诱导的侵袭[7]；而在抗凋亡的乳腺癌细胞中，Fas信号通路则是通过NFκB途径的激活而发挥作用；此外，Fas信号通路诱导的JNK的激活在小鼠肿瘤和人类肿瘤中均发挥作用[1]。我们的实验结果与以上结果相似。因此我们推测，在不同的肿瘤细胞中，FasL能够激活不同的信号途径并产生相应的通路效应。

为了证实我们的研究结果，在病理组织内分析FasL和E-cadherin的表达。一些报告显示在结肠癌的进展期，FasL表达上调而同时E-cadherin表达下降[13]，然而，上皮样标记E-cadherin蛋白和间质样标记物Vimentin蛋白同时在胃癌标本中的表达则少有研究。我们的实验结果发现，这两种标记物在未转移的胃癌组织和已经转移的胃癌组织中的表达呈相反状态，提示FasL在体内可能诱导EMT的发生。

综合上述实验结果，我们认为在胃癌肿瘤中，Fas信号通路可通过激活ERK1/2通路诱导EMT的产生，促进肿瘤细胞的运动。而Fas信号通路在其他类型的肿瘤中能否诱导EMT产生以及相应的调节机制有待进一步研究。

1Chen L,Park SM,Tumanov AV,et al.CD95 promotes tumor growth.Nature.2010 May 27;465(7297):492-496.

2Barnhart BC,Legembre P,Pietras E,et al.CD95 ligand induces motility and invasiveness of apoptosis-resistant tumor cells.EMBO J,2004,;23(15):3175-3185.

3Curtin JF,Cotter TG.Live and let die:regulatory mechanisms in Fas-mediated apoptosis.Cell Signal,2003,15(11):983-992.

4Huber MA,Kraut N,Beug H.Molecular requirements for epithelialmesenchymal transition during tumor progression.Curr Opin Cell Biol,2005,17(5):548-558.

5Choi C,Xu X,Oh JW,et al.Fas-induced Expression of Chemokines in Human Glioma Cells:Involvement of Extracellular Signal-regulated Kinase1/2 and p38 Mitogen-activated Protein Kinase.Cancer Res,2001,61(7):3084-3091.

6Kleber S,Sancho-Martinez I,Wiestler B,et al.Yes and PI3K Bind CD95 to Signal Invasion of Glioblastoma.Cancer Cell,2008,13(3): 235-248.

7Lavrik IN,Golks A,Riess D,et al.Analysis of CD95 Threshold Signaling.J Biol Chem,2007,282(18):13664-13671.

8Li H,Cai X,Fan X,et al.Fas Ag-FasL coupling leads to ERK1/2-mediated proliferation of gastric mucosal cells.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008,294(1):G263-275.

9Kalluri R.EMT:When epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells.J Clin Invest,2009,119(6):1417-1419.

10 Medici D,Hay ED,Goodenough DA,et al.Cooperation between Snail and LEF-1 transcription factors is essential for TGF-1-induced epithelial-mesenchymal transition.Mol biol cell,2006,17(4): 1871-1879.

11 Yan W,Fu Y,Tian D,et al.PI3 kinase/Akt signaling mediates epithelial-mesenchymal transition in hypoxic hepatocellular carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun,2009,382(3):631-636.

12 Pryczynicz A,Guzi?ska-Ustymowicz K,Kemona A.Fas/FasL expression in colorectal cancer.An immunohistochemical study.Folia Histochem Cytobiol,2010,48(3):425-429.

13 Tsanou E,Peschos D,Batistatou A,et al.The E-cadherin adhesion molecule and colorectal cancer.Anticancer Res,2008,28(6A):3815-3826.

Fas signaling promotes metastasis through EMT in gastric cancer

SHI Meng1,NAN Xing-jian2,LI Wenjing1,WANG Ya-dong1,ZHENG Hao-xuan1.1)Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,Southern Medical University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Gastroenterology,Guangzhou 510515,China; 2)Nursing Department,Jiangning Hospital,Nanjing,Jiangsu Province,211100.Correspondence to:Haoxuan ZHENG,E-mail:ryan801218@aliyun.com.Project was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant No.81201962),Natural Science Foundation of Guangdong Province,China(Grant No. S2012040006985),Doctoral Fund of Ministry of Education of China(Grant No.20124433120003)

ObjectiveTo explore the possible mechanisms of the metastasis promotion induced by Fas signaling pathway in gastric cancer.Methods Gastric cancer cell line AGS was treated with low-dose FasL and the alteration of EMT(epithelial-mesenehymal transition)biology markers were detected by immunoblot and enzyme linked immunosorbent assay，respectively.Two transcription factors Snail and Twist were stablely knocked-down,and transwell chamber migration assay was performed to measure the motility of the pretreated gastric cancer cells.Immunoblot was used to assess the activations and the motility changes of AGS after pretreated with inhibitor of relative pathways during the procedure.Results FasL induced the occurrence of EMT in AGS cell line,which might contribute to the motility and metastasis of gastric cancer cells.In the process of EMT,ERK1/2 signaling pathway was activated and the suppression of this pathway inhibited the Fas induced EMT and improved the migration ability of gastric cancer cells.The expression variation of relevant biology markers in gastric cancer tissues was correspond to EMT occurrence.Conclusion Fas signaling pathway can promote the metastasis of AGS cell line through EMT with the activation of ERK1/2 pathway.

Fas signaling pathway;EMT;ERK1/2 signaling pathway

2013-11-13）

（本文编辑：吴保平）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.02.001

1 510515广东省胃肠疾病重点实验室，南方医科大学南方医院消化内科；2 211100江苏省南京市江宁医院护理部

共同第一作者：石萌、南兴建

郑浩轩，E-mail：ryan801218@aliyun.com

中国国家自然科学基金(No.81201962)广东省自然科学基金(No.S2012040006985)教育部博士点基金(No.20124433120003)