响应面法优化微生物诱导碳酸钙沉积培养基

竹文坤，牟涛，段涛，张友魁，罗学刚

（1 西南科技大学中国工程物理研究院激光聚变研究中心极端条件物质特性联合实验室，四川 绵阳 621000；2 中国工程物理研究院，四川 绵阳 621000）

自然界中的成岩微生物通过其自身的生命活动，与周围环境介质之间不断发生酶化作用，逐渐矿化形成胶结物质CaCO3。微生物成岩作用需经历漫长地质时期的累积，最终将自然界中的疏松的岩石碎屑胶结成坚硬的岩石[1-5]。受此自然现象启发，可利用成岩细菌——碳酸盐矿化菌，提供其适宜的生长、培养和活化反应条件，加速其酶化作用，沉积出CaCO3，在较短时间内将石质材料胶结起来。这项技术环境友好，可广泛应用于建筑物和古迹裂缝的修复[4-5]、沙土的加固[6]、水泥基材料改性[7-9]、土壤重金属降解[10-11]等领域。该技术利用某些特定细菌自身代谢活动，与周围环境介质之间不断发生酶化作用，分解尿素，使溶液中的 CO浓度不断增加。菌体细胞膜界面处带负电荷的水可溶有机质中不断螯合Ca2+，诱导出局部的晶体阴离子（CO）浓度进一步增大，从而吸引更多的Ca2+，直到晶体前驱物浓度增大到利于核化，沉积出CaCO3颗粒。但是，微生物沉淀 CaCO3过程中，沉淀的 CaCO3晶型、形貌、沉淀量和堆积密度等受营养条件和生长环境的影响。由于诸多因素没有协调控制，使得微生物在沉积CaCO3时速度慢，时效差。因此，如何提高微生物沉淀CaCO3产率，是微生物修复技术应用的关键。国内外对于微生物矿化机理研究多有报道[12-16]，但是对于微生物沉淀CaCO3培养基优化在国内外的文献资料中，尚未见这方面详细深入的研究报道。为此，本研究利用微生物诱导CaCO3的沉积，通过二次旋转正交实验，探讨葡萄糖、蛋白胨、尿素、硝酸钙、吐温和氯化镍等因素对CaCO3沉淀量的影响，对培养基的组分进行优化，以期提高微生物沉积CaCO3的产率，为微生物修复技术的时效性提供理论和实际指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

根据碳酸盐矿化菌的酶化特征要求，选用购自美国ATCC（美国菌种保藏中心）的巴斯德芽孢杆菌（bacillus pasteurii，ATCC11859）。

1.1.2 培养基

斜面培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH值8.0。

液体种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH值8.0。

LB培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，pH值7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH值7.0。

1.1.3 实验仪器

扫 描 电 子 显 微 镜 （ Scanning electron microscopic，SEM），EVO 18型，德国蔡司公司；X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD），X’Pert Pro型，荷兰帕纳科公司；同步热分析仪（Thermal analyzer，TA），SDT Q600型，美国TA仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种制备

将巴斯德芽孢杆菌保藏菌种转接于新鲜试管斜面，30℃培养24h，保存于4℃冰箱备用。从保存的斜面培养基中用接种环挑取 5环菌苔接种于装有100m L液体种子培养基的250m L三角瓶中，30℃，150r/m in摇床培养24h，活菌量4.94×109cfu/m L，保存于4℃冰箱备用。

1.2.2 正交实验

以葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、尿素浓度、硝酸钙浓度、吐温浓度、氯化镍浓度作为实验因素，采用6因子5水平的二次回归旋转组合体设计L36（65）正交表进行沉淀条件优化实验，具体实验方法设计参考文献[17-19]进行，以CaCO3的沉积量为考察指标。配制好培养基，pH值调至8.0，在500m L三角瓶封装250m L培养基溶液，1×105Pa灭菌30min，冷却。用微孔过滤器加尿素和硝酸钙，接种5%（体积分数）的液体种子，30℃、170r/m in摇床振荡培养48h，静置24h，过滤，沉淀物用乙醇和超纯水洗涤3次，置于50℃烘箱内烘48h，称量。正交实验的水平与因素的确定见表1。

1.2.3 样品分析

SEM放大1000～10000倍观察产物的形貌；利用XRD对产物进行晶型分析；在40～900℃范围内，升温速度为 20℃/m in 的条件下对样品进行热分析。由于CaCO3的分解温度为600～850℃，根据在该范围内失重的CO2的质量分数，可计算沉淀样品中CaCO3的含量。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果与分析

表1 正交实验水平与因素

按上述正交实验配方进行处理，培养基成分对巴斯德芽孢杆菌诱导 CaCO3沉淀量影响的正交实验结果如表2所示。

表2 二次回归旋转正交实验结果

使用DPSv12.01软件对表2中的巴斯德芽孢杆菌诱导CaCO3沉淀量的数据进行拟合，可以模拟出CaCO3沉淀量与参试因子之间的二次回归数学模型，如式（1）。

式（1）的失拟性检验 F1=0.46076＜F0.05(4，7)=4.12，说明模型不存在失拟因素。显著性检验F2=16.82608＞F0.01(24，7)=3.41，达到极显著水平，说明回归是极显著的，此模型可信度好。F检验结果表明X2、X3、X5均在0.01水平上差异显著，说明3个因素对CaCO3沉淀量均有极显著的影响。由式1知，X1、X3和X4起正效应，X2、X5和X6起负效应；X和X均起正效应，X、X、X和X起负效应；X1X2、X1X4、X1X5、X2X3、X3X4、X3X5、X3X6和X5X6两因子互作后起正效应，X1X3、X1X6、X2X5和X4X5两因子互作后分别起负效应。

在α=0.10的显著水平，剔除不显著项，简化后的回归方程见式（2）。

2.1.1 单因子效应分析

由DPSv12.01软件对表2中CaCO3沉淀量数据进行非线性拟合，得到影响巴斯德芽孢杆菌诱导CaCO3沉淀量的主因子效应分析如图1。由图1可知，氯化镍的含量对CaCO3沉淀量影响不显著，但从成本和促进尿素酶活性效果考虑，氯化镍用量不宜太大。随着培养基中大豆蛋白胨浓度、吐温 80浓度的增加，CaCO3沉淀量均呈现下降趋势；随着培养基中葡萄糖浓度的升高，CaCO3沉淀量呈现出先增大后减小的趋势；随着培养基中尿素的增加，CaCO3沉淀量呈增加趋势；随着培养基中硝酸钙浓度的增加，CaCO3沉淀量呈现先减小后增加的趋势。

2.1.2 双因子效应分析

由式2简化回归方程，可知X1X3、X1X4、X1X5、X4X5、X3X6双因子互作效应对CaCO3沉淀量影响极显著。由实验数据作双因子互作效应图，每个响应面分别代表两个因子之间的相互影响，其他变量保持在0水平，如图2～图6所示。

由图2～图6可以看到葡萄糖与尿素、葡萄糖与硝酸钙、葡萄糖与吐温80、硝酸钙与吐温80、尿素与氯化镍两两交互作用的响应面图，可直观看出各因子对响应值影响的变化趋势。从图2中可以看出，当葡萄糖浓度在低水平时，随培养基中尿素浓度的增加，CaCO3沉积量先增加后减少；而葡萄糖浓度在高水平时，CaCO3沉积量却随尿素浓度的增加大幅度降低。当尿素浓度在低水平时，随培养基中葡萄糖浓度的增加，CaCO3沉淀量大幅度增加；而尿素浓度在高水平时，CaCO3沉淀量受葡萄糖影响较小。图3～图6可做类似分析。

图1 单因子效应分析

图2 葡萄糖（X1）和尿素（X3）双因子效应图

图3 葡萄糖（X1）和硝酸钙（X4）双因子效应图

图4 葡萄糖（X1）和吐温80（X5）双因子效应图

图5 硝酸钙（X4）和吐温80（X5）双因子效应图

图6 尿素（X3）和氯化镍（X6）双因子效应图

根据式 2，结合单因子效应分析和双因子交互效应分析，使CaCO3沉积量达到最大的X1、X2、X3、X4、X5、X6的因素组合为0、-2、2、2、-2、2，即葡萄糖30g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素50g/L、硝酸钙0.5mol/L、吐温80体积分数0.05%、氯化镍250μmol/L。

2.2 SEM分析

对沉淀粉末样品的 SEM分析，结果表明，36个样品CaCO3颗粒形貌和堆积密度基本相似，颗粒大小存在差别。沉淀粉末样品C1和C3的SEM分析如图7所示。由图可知，C1和C3无规则块状体团聚体，表面粗糙，分布杂乱无章，C1团聚体较大，间隙较大，而C3团聚体较小，间隙较小。且所有沉淀样品表面存在 1～2μm印痕（如图中箭头所指），推测为菌体冲洗后遗留下来的，说明菌体参与了CaCO3晶体的形成。

2.3 XRD分析

图7 沉淀CaCO3晶体扫描电镜图

对沉淀粉末样品进行 XRD分析，结果表明，36个CaCO3样品晶型是方解石和球霰石混合晶型。所有样品都出现方解石和球霰石特征峰，位置基本相同，但是峰的相对强弱发生了一些变化，即方解石和球霰石相对含量不同。沉淀粉末样品C1和C3的XRD如图8所示。由图8可知，对照PDF标准卡的有关数据，沉淀粉末样品出现方解石特征峰，主要衍射角 2θ=23.0°、29.4°、35.9°、39.5°、43.1°、47.5°、48.5°、58.5°，分别对应（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）、（116）、（122）晶面。对照PDF标准卡（PDF No：00-024-0030）的有关数据，沉淀粉末样品出现球霰石特征峰，主要衍射角2θ=20.9°、24.8°、27.0°、32.7°、43.8°、49.9°、55.7°，分别对应（002）、（100）、（101）、（102）、（110）、（104）、（202）晶面。

图8 沉淀CaCO3样品XRD谱图

2.4 TG/DSC分析

对沉淀粉末样品进行TG/DSC分析，结果表明，36个CaCO3样品的TG/DSC曲线基本相似。沉淀粉末样品C1进行TG/DSC分析如图9所示。由图9可知，在0～200℃范围内，样品TG曲线因水分热分解脱附略呈下降趋势，在 200～600℃有失重台阶，这是由于球形CaCO3样品内有机质及残留细菌分解的结果，失重率为5.32%；在600～800℃有一个大的失重台阶，同时在该温度范围内 DSC曲线上有一吸热峰，归属为 CaCO3分解峰，其失重率为41.67%。

3 结 论

图9 沉淀CaCO3样品C1的TG/DSC谱图

通过对微生物诱导 CaCO3沉积培养基优化实验，可知在适宜的培养条件下，葡萄糖、大豆蛋白胨作为营养物质，在吐温80和氯化镍促进作用下，尿素诱导产生大量高活性的尿素酶，尿素大量被分解形成CO，再与Ca2+作用，形成大量的CaCO3沉积。沉积CaCO3形貌呈无规则块状体团聚体，表面粗糙，分布杂乱无章，粒径在20～100μm，并含有少量有机物。晶型是方解石和球霰石混合晶型，菌体参与了CaCO3晶体的形成。为提高微生物沉积CaCO3的沉积量，钱春香等[20]对培养基浓度、底物浓度、细菌接种量和成核剂4个因素进行正交实验，培养后引入氯化钙，形成CaCO3沉淀。实验表明，培养后再引入钙源，将会给野外施工带来不便，成本也会增加。在培养前引入钙源，使微生物在代谢过程中快速形成CaCO3是比较科学的工艺。所以，本实验研究不同配比的葡萄糖、大豆蛋白胨、氯化镍、尿素、吐温80、硝酸钙等协同作用下对诱导碳酸高沉淀量的影响是具有实际意义的。但本实验主要原料是葡萄糖、大豆蛋白胨等精细原料，生产成本较高，使用价廉易得的农副产品作为主要原料对培养基进行优化、提高CaCO3沉淀量以及各培养成分对尿素酶产量及活性的影响等方面还需要深入研究。

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