DRE2基因参与酵母内质网应激调控机制的初步研究＊

赵 炜，牛宇杰，袁 源，刘新光，2△

（1.广东医学院衰老研究所／广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞523808；2.广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023）

DRE2从酵母到人类都很保守，它的蛋白结构中含有铁硫簇，因此被划分为铁硫蛋白［1］。铁硫蛋白具有广泛的生理功能，例如参与电子呼吸链中的电子传递，催化三羧酸循环，参与DNA 修复和神经系统的发育等［2］。DRE2是细胞质铁硫簇组装机器（cytosolic iron-sulfur cluster assembly，CIA）复合体的成员之一。酵母DRE2 人类的同源蛋白是CIAPIN1（cytokine-induced apoptosis inhibitor 1），具有抗凋亡的作用，研究发现在一些对抗肿瘤药物具有抗性的细胞系中CIAPIN1呈现高表达状态［3］。

酵母DRE2主要位于细胞质和线粒体内膜上，DRE2基因缺失酵母菌株表现出致死的表型，在氧化应激条件下，DRE2和TAH18可以形成蛋白质复合体，共同参与维持线粒体的完整性和生存［4-5］。本文利用二倍体酵母作为研究对象，构建DRE2基因杂合缺失酵母菌株，发现DRE2基因杂合缺失酵母菌株对抗肿瘤药物衣霉素表现出抗药性，并且初步研究了其分子机制。为全面研究DRE2基因功能和内质网应激机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 野生型二倍体酵母菌株BY4743、载体pRS306由美国华盛顿大学Matt Kaeberlein博士赠送。La tap酶（货号RR02MA）购自Takara公司；引物合成、测序由英骏生物科技有限公司完成；其他常规试剂为本实验保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 DRE2-URA-F：5′-ACA TTT GAT CTA AGC ATA TAC ACT GTA AGT GAA GGT ATC GAG ATT GTA CTG AGA GTG CA-3′；DRE2-URA-R：5′-AGA CCA ATT GAC GTC ATT TAC TGA AAC GAA TGT GCA GGG TCT GTG CGG TAT TTC ACA CCG-3′；DRE2-F：5′-TCT CGG GGG TAT GAT GGA CT-3′；DRE2-F：5′-ACA TCA AAA GGC CTC TAG GTT CC-3′。

1.2.2DRE2基因破坏元件的扩增以质粒pRS306作为PCR模板，DRE2-URA-F、DRE2-URA-R为引物，扩增含有URA3开放阅读框的破坏元件，全长为1 232bp。Taq酶采用的是La tap，反应体系按照试剂说明书进行，PCR 反应条件为94 ℃1min；94 ℃30s，58 ℃30s，72 ℃1min，33个循环；72℃5min。

1.2.3DRE2基因缺失酵母菌株的构建 将DRE2基因破坏元件转化进野生型酵母BY4743，通过基因重组原理替换掉野生型酵母基因组上的DRE2基因［6］。利用URA 缺陷型培养板筛选阳性克隆。酵母感受态的制备和转化方法参考分子克隆进行［7］。阳性克隆在液体URA 缺陷型培养基中培养过夜，提取基因组后通过PCR 鉴定，鉴定引物为DRE2-F、DRE2-R，Taq酶采用的是La tap，PCR 反应条件为94 ℃，1min；94 ℃，30s，58 ℃，30s，72 ℃，2min，35个 循 环；72 ℃，5min。

1.2.4DRE2基因缺失酵母菌株的克隆形成实验 取等量吸光度（A）值处于对数生长期的野生型菌株和DRE2基因缺失酵母菌株，用无菌水倍比稀释之后，分别取5μL 滴在YPD 固体培养板和含2μmol／L衣霉素的YPD 固体培养板上，然后置于30 ℃恒温培养箱中培养至克隆形成，实验结果重复3次。

1.2.3DRE2基因缺失酵母菌株复制寿命的检测 酵母复制寿命的检测分析方法按照文献［8-9］的方法进行，在显微镜下分离、统计酵母母细胞产生子细胞的个数。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，酵母复制寿命结果以平均数表示，采用Wilcoxon秩和检验方法进行统计学分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DRE2基因破坏元件的扩增结果DRE2基因破坏元件全长为1 232bp，PCR 扩增产物大小经过琼脂糖凝胶电泳确认正确，见图1。

2.2DRE2基因缺失酵母菌株的鉴定DRE2基因被URA3替换之后，利用位于DRE2基因编码区外侧的1条鉴定引物和位于URA3 内部的1 条引物可以将野生型菌株（因为无URA3替换原件，所以无扩增片段）和DRE2基因缺失酵母菌株（1 428bp）区分，见图2。

图1 DRE2基因破坏元件的扩增结果

2.3DRE2基因缺失菌株对衣霉素抗性的检测 衣霉素是一种经典的内质网应激诱导剂，本研究发现DRE2 基因杂合缺失酵母菌株在添加了2μmol／L 衣霉素的YPD 固体培养基上的克隆形成能力显著高于野生型酵母菌株（实验结果重复3次），见图3。

2.4DRE2基因缺失菌株复制寿命的测定 本研究同时检测了野生型酵母菌株和DRE2基因杂合缺失酵母菌株的复制寿命（图4），结果显示：两者平均寿命分别是34、29代，DRE2基因杂合缺失酵母菌株的复制寿命相对野生型菌株缩短了14.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 PCR 鉴定DRE2基因缺失酵母菌株

图3 酵母菌株对衣霉素抗性的检测

图4 酵母菌株复制寿命的检测

3 讨 论

酿酒酵母是简单的单细胞生物，遗传背景清晰，易培养、生活周期短，因此成为研究基因功能的重要模式生物，被广泛应用于药物筛选、衰老等研究领域［10］。

衣霉素是一种天然的核苷抗菌药物，可以阻碍内质网内新生蛋白质糖基化修饰，造成内质网中未折叠蛋白质蓄积，最终导致细胞的坏死或者凋亡。内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质堆积于内质网内，会激发细胞保护性的应答反应，即内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），也称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。适度的内质网应激能降低细胞内的蛋白质合成水平，促进蛋白质的正确折叠，或者使错误折叠的蛋白降解，起到保护细胞的作用。但过度的应激反应会激活相应的凋亡调节因子［11-12］。衣霉素作为经典的内质网应激诱导剂，在许多实验中已经被证实可以与多种抗肿瘤药物联合运用，诱导肿瘤细胞凋亡，但是具体的分子机制还不甚明了［13-14］。

本研究发现，DRE2基因杂合缺失酵母的菌落形成能力明显大于野生型，表明DRE2 基因杂合缺失酵母对衣霉素的抗性明显高于野生型菌株，暗示DRE2很可能参与内质网应激的调节，可能在内质网应激中起负调控作用。

研究表明，内质网应激反应会随着细胞衰老而发生一些改变，导致或者加剧细胞衰老的进程［15］。为了进一步研究DRE2基因杂合缺失酵母在含有衣霉素的固体培养基上的菌落形成能力大于野生型是否与其复制寿命（指一个酵母细胞在死亡之前所能分裂增殖的次数，即产生子细胞的个数）有关，本研究检测了两者的复制寿命，结果显示：DRE2基因缺失酵母菌株的复制寿命明显低于野生型菌株，表明DRE2 基因杂合缺失酵母对衣霉素的抗性增加不依赖于其复制寿命。

综上所述，DRE2基因可能作为酵母内质网应激的负调控因子，调节细胞内质网的未折叠蛋白反应，同时参与酵母的复制寿命的调控。这对于进一步研究内质网应激机制，揭示衣霉素的抗肿瘤作用机制提供了有益借鉴。

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