miR-424慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖的影响＊

李 清，杨宇馨，戴 楠，代晓燕，任 涛，王 东，卿 毅

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心，重庆400042）

miRNA 是一类由19～24个碱基组成的小分子非编码调控的内源性单链RNA，与mRNA 的3′非翻译区结合，以降解mRNA 或抑制其翻译，从而在转录后水平负性调节靶mRNA的表达［1］。miRNA 广泛存在于各种生物体内，对细胞周期调节、生长、发育、凋亡等过程发挥重要的作用；不仅影响了生物体的生长发育，并与多种人类疾病的发生密切相关［2］。目前已鉴定的人类miRNA 有数千种，调控数千种靶mRNA。近年来一些研究证实，某些miRNA 参与肿瘤的发生、发展过程，具有抑癌基因或者癌基因的功能［3-4］。同时，与越来越复杂的蛋白网络相比，miRNA 作为一种新的强有力的工具，在肿瘤诊断、疗效预测和治疗靶点确定等研究中更具有独特优势。早期的研究表明，miR-424 可以作为一个潜在的肿瘤抑制基因表达谱［5-7］。例如，1项研究表明miR-424表达的异常下降，伴随着对慢性淋巴细胞的致癌基因PLAG1强有力的抑制［8］。然而，有报道指出在EB病毒感染有关的B细胞淋巴瘤、舌鳞状细胞癌与结肠癌中miR-424 表达却增高［9-11］。经一些研究发现，miR-424在宫颈癌组织中也呈特异性低表达，同时在宫颈癌放疗耐受细胞株中显著下调。本研究旨在构建miR-424慢病毒质粒载体，并初步探索miR-424对宫颈癌Hela细胞增殖情况的调控，为下一步探讨miR-424在宫颈癌放疗抵抗中的作用机制及建立稳定高效的Hela细胞株打好基础。

表1 引物序列

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌细胞株Hela、293T 细胞、DH5α、慢病毒表达载体pMD18T、辅助包装载体pMD2.G、pSPAX2（本实验室保存）；DMEM 培养基购自Gibco公司；胎牛血清、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司；限制性内切酶购自New England公司；DNA 连接酶购自Promega公司；DNA 聚合酶、T 载 体 试 剂 盒、SYBR premix Ex Taq Ⅱ、DNA marker（500～12 000）均购自Takara公司；TRIzol来源于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列 所用引物由Invitrogen公司设计合成，根据miR Base数据库获得miR-424基因的前体序列，应用Primer 5.0软件设计合成引物（引物的上下游分别含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点），见表1。以人基因组DNA 为模板扩增，反应程序：98 ℃2min，98℃10s，58℃20s，72℃30s，30个循环。对扩增产物回收，将其与pMD18T 载体连接，进行测序。PCR 扩增pMD18T-miR424，载体质粒为pLentis-CMV-GFPMCS-PGK-PURO，37 ℃酶切扩增产物和载体质粒。酶切产物连接体系：酶切回收载体DNA 2μL、酶切PCR 产物2μL、DNA 连接酶缓冲液1μL、DNA 连接酶0.5μL、dd H2O 4.5 μL，16 ℃连接过夜，转化细菌。挑取阳性克隆，使用Omega公司质粒提取试剂盒提取质粒，37℃酶切4h，经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，鉴定正确的克隆进行下一步实验。

1.2.2 慢病毒载体的包装与感染 转染前24h，用胰酶消化对数期生长的293T 细胞，计数后将密度5×105细胞铺入6孔培养板中，培养体积为2 mL，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。24h后观察细胞状态，若状态良好，则进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μmol／L，取1只试管，加入灭菌水及以下质粒（pMD2.G 1.5μg，pSPAX2 4.5μg，pLentis-CMV-GFPMCS-PGK-PURO 或pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO 6.0μg），总体积为328.5μL，然后加入2 mol／L CaCl246.5 μL，混匀，最后再加入375μL 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，尽快将混合物加入到细胞培养皿中，轻轻摇晃混匀。转染12h后换为新鲜培养基2mL，48h后观察细胞状态并收集上清液，500g离心10min，然后将上清液用0.45μm 滤器过滤，-70 ℃保存。用病毒液转染293T 细胞，50μL 感染72h，确认病毒成功构建，取构建成功的病毒液感染Hela细胞。

1.2.3 运用RT-PCR检测慢病毒感染宫颈癌细胞后miR-424的表达 用包装获得的慢病毒液感染宫颈癌Hela细胞，24h后换为新鲜培养基，扩大培养至6 孔板，用荧光显微镜观察GFP的表达；当感染率超过50%时，可用适宜浓度的puromycin进行筛选。感染5d后，选择3～5个孔用荧光显微镜观察表达GFP的细胞的平均数，再用其平均数与总细胞的平均数的比值，估计出慢病毒的转染效率。收集细胞，采用RT-PCR检测miR-424的表达，反应 程 序：95 ℃20s，95 ℃10s，60 ℃20s，70 ℃10s，40个循环。实验数据采用2-△△Ct方法计算，上述实验重复4次。

1.2.4 MTT 检测各细胞株增殖结果 调整细胞悬液密度为1×104个／mL，将细胞悬液加入到96孔板，每孔加200μL，细胞株在1块96孔板上接种5孔，另外设置1个孔作为对照，共需接种6块板。对接种的细胞常规培养，每隔2d换1次液，每日在固定时间处理一块培养板，每孔加入MTT 20μL，37℃孵育4h后，每孔加入150μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，再用酶联免疫仪选择490nm 对吸光度（A）值进行测定，最后取5个孔平均值，制作增殖曲线。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，组间两样本均数比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-424的扩增 以人基因组作模板，使用Takara公司的Extaq聚合酶进行扩增反应，DNA 测序证明扩增片段的序列与miRBase数据库获得miR-424基因的前体序列完全一致（序列未列出）。

图1 构建的载体中的酶切位点

2.2 重组慢病毒质粒载体的酶切测序鉴定 选取酶切鉴定正确的克隆pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO重组质粒的阳性克隆的PCR 产物，1%琼脂糖凝胶电泳，经测序证实Clone2序列正确，构建的载体中有3 个PstⅠ的酶切位点，分别位于6 457bp、1 168bp、915bp，见图1。

图2 质粒对细胞的转染效率

图3 293T 细胞转染后miR-424的表达水平

图4 慢病毒上清液对宫颈癌Hela细胞的转染效率

图5 Hela细胞转染后miR-424的表达水平

2.3 质粒对293T 细胞的转染效率 鉴定构建的质粒pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO对293T 细胞的转染效率，转染效率在90%以上（图2）；以2-△△Ct分析法计算，转染48h后miR-424的表达量提高了45倍，见图3。

2.4 miR-424慢病毒上清液对宫颈癌Hela细胞的转染效率 鉴定构建的慢病毒上清液对宫颈癌Hela细胞的转染效率，转染效率在90%以上（图4）；以2-△△Ct分析法计算，病毒感染后miR-424的表达量上调近60倍，见图5。

2.5 MTT 检测Hela细胞的增殖结果 采用miR-424慢病毒上清液转染的宫颈癌Hela细胞，MTT 法检测增殖结果提示感染miR-424慢病毒的宫颈癌Hela细胞株均存在细胞增殖明显减慢，见图6。

图6 MTT 检测Hela细胞的增殖结果

3 讨 论

宫颈癌是严重危害我国妇女健康的恶性肿瘤之一，目前每年新增宫颈癌病例130 000余例、死亡50 000余例，其发病率与病死率分别占我国妇科肿瘤的第一、第二位［12］。在基因调控网络中，miRNA 作为其调控的关键成分，通过调控基因的表达，miRNA 广泛参与到对细胞死亡、分化、增殖及个体的发育等各种生命活动过程的调控。

Ghosh 等［13］研究也表明，在缺氧状态下，冠状动脉内皮细胞中miR-424表达升高，抑制Cullin-2蛋白表达，降低E3连接酶的合成，增加HIF-1α／HIF-2α在内皮细胞的表达，增强内皮细胞的增殖和迁移能力，在心肌缺血、缺氧后改善血供重构和促进血管新生中发挥重要作用。近年一些研究也证实，miRNA 参与肿瘤的发生、发展。Chow 等［14］发现，miR-424在肾透明细胞癌中的表达远高于肾乳头状细胞癌。Wang等［15］在对宫颈癌miRNA 表达谱的研究中发现miR-424 在宫颈癌及CIN 组织中呈低表达。Emmanue Labourier将miR-424 低表达作为诊断宫颈癌或CIN 的指标之一，并运用在其研发的用于宫颈癌的特异性miRNA 芯片中，因此miR-424可能是宫颈癌特异性miRNA 标签。miR-424可能通过下游某个靶基因，如CDC25A（细胞周期调控相关的基因）等来抑制宫颈癌细胞增殖［16］。Xu等［17］研究发现，恢复miR-424的表达将显著影响宫颈癌细胞生物学行为，包括抑制扩散，增强细胞凋亡。

本研究构建了pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO慢病毒载体，并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌Hela细胞，成功抑制了宫颈癌Hela细胞的增殖。然而在miRNA 与肿瘤关系方面的研究，还需解决很多关键问题。miRNA 的加工过程复杂有序并且受多种因素精密调控。尽管当前已初步明确了miRNA 的加工过程中的某些重要步骤，但其中一些具体的调控因素、调控通路尚未研究清楚［18］。因此，还需在以后的研究中继续探索。

综上所述，本实验采用分子克隆技术成功构建了miR-424的慢病毒载体，并构建了基于宫颈癌Hela细胞的高效转染系统，并证实了被miR-424慢病毒感染后的宫颈癌Hela细胞株表现出增殖抑制，为下一步研究miR-424在宫颈癌中的作用靶点以及对其进行功能研究和体外实验奠定了基础。

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