格列卫对K562细胞中miR-146a、miR-29b及3种甲基化酶表达的影响＊

王丽娜，曾建明，王华成，李 沫，龙一飞，邓光远，陈 茶

（1.广东省中医院大学城医院检验科，广东广州510006；2.广州市脑科医院检验科，广东广州510370）

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是造血干细胞水平发生的获得性恶性血液肿瘤。染色体异位t（9；22）（q34；q11）形成BCR／ABL融合基因，其编码的特异性融合蛋白BCR／ABL具有强烈酪氨酸激酶活性，异常调控多种生物学行为，引发宿主细胞恶性转化。BCR／ABL调节的主要信号通路有 NF-κB、STATs、PI3K、RAS-MAPK 等。NF-κB二聚体对靶启动子的结合启动了多种免疫调节基因的转录激活。

通过抑制BCR／ABL融合蛋白的活性，进而逆转其下游信号通路来治疗CML已有数年的历史，其中最有代表性的BCR／ABL抑制剂就是格列卫。格列卫是特异性的BCR／ABL酪氨酸激酶抑制剂。用格列卫抑制CML细胞的BCR／ABL活性会抑制NF-κB的转录活性［1］，受 NF-κB调控的基因表达也将受到抑制［2］。

Starczynowski等［3］研究了急性白血病细胞系HL-60细胞中microRNA（miR）-146a的表达情况，发现HL-60细胞在用5-aza处理后，miR-145及miR-146a的水平呈3倍以上的升高。但对于CML细胞中miR-146a表达情况的研究尚未见报道。

本研究目的是观察格列卫作用后，NF-κB的下游靶基因miR-146a的表达情况，检测能够抑制甲基化酶表达的miR-29b水平的变化，并且检测3种甲基化酶基因的表达水平，为分析miR-146a的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司，台盼蓝、MTT试剂分别为BBI公司及上海生工产品。格列卫（100mg相对分子质量589.7）为瑞士诺华公司产品。Trizol试剂购于东盛生物公司，Bio-Rad Ssofast EvaGreen PCR kit购于美国Bio-Rad公司，Fermentas逆转录PCR试剂盒购于法国Fermentas公司，U6、miR-146a、miR-29b逆转录及正、反向引物为广州锐博公司产品，DNMTs引物由Invitrogen公司合成，GoldView核酸染料为赛百胜公司产品。所用的3种甲基化酶（DNMTs）引物序列如下，DNMT1上游：5′-GAG GAA GCT GCT AAG GAC TAG TTC-3′，下游：5′-ACT CCA CAA TTT GAT CAC TAA ATC-3′，产物大小：190bp；DNMT3a上游：5′-CAG CTT CCA CGT TGC CTT CT-3′，下游：5′-CAT CTG CAA GCT GTC TCC CTT T-3′，产物大小：66bp；DNMT3b上游：5′-TAC ACA GAC GTG TCC AAC ATG GGC-3′，下游：5′-GGA TGC CTT CAG GAA TCA CAC CTC-3′，产物大小200bp。

1.2 K562细胞培养及格列卫IC50确定

1.2.1 K562细胞培养 使用含10%胎牛血清（使用前于56℃恒温水浴箱中放置30min以灭活补体）的RPMI1640培养基，细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，适时换液及传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 格列卫配置 母液 A，浓度为10mmol／mL；母液B，浓度为3.33μmol／mL；母液C，浓度为500μmol／L。

1.2.3 4%的台盼蓝母液配置 1g台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加0.9%NaCl至25mL，用滤纸过滤，4℃保存。染色时，将2μL染液及18μL细胞悬液混合，充入计数池，立即于显微镜下计数，计算细胞抑制率（%）＝死细胞数／细胞总数×100%。

1.2.4 配置5mg／mL MTT试剂 使用时于180μL细胞培养体系中加入上述 MTT溶液20μL（即 MTT终浓度为1mg／mL）。按每孔1 000个细胞接种至96孔板（总体积为180μL）置于37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养24h后，加入不同浓度的格列卫，每一浓度设3个平行孔，阴性对照加入等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。继续培养48h后每孔加入MTT试剂，继续培养4h，将培养板进行离心，吸弃上清液，每孔中加入150μL DMSO，在492nm（检测波长）／630nm（参比波长）处进行检测。以不加药物的对照孔吸光度OD值在0.8～1.2为佳。

1.3 荧光定量PCR检测mRNA

1.3.1 总RNA提取 分别取格列卫处理的K562细胞、及生理盐水处理（阴性对照）的K562细胞各1×106个。用PBS洗涤一次，置于1.5mL EP管中，加入1mL Trizol试剂，充分混匀。加入0.2mL氯仿，盖紧后剧烈振荡15s，室温静置5min，4℃12 000×g离心15min。取上层水相置于一新EP管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻颠倒，充分混合均匀后，室温静置10 min。4℃12 000×g离心10min。弃上清液，加入1mL 75%乙醇，漩涡混匀，4℃7 500×g离心5min。弃上清液，室温干燥10min，加20μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。在Nanodrop核酸定量分析仪上测定RNA浓度。

1.3.2 逆转录 miRNAs的逆转录反应步骤如下：首先加入RT-PCR反应体系的试剂并进行变性退火：RT-PCR引物（62.5nM）2μL，RNA 2μL，加ddH2O至19μL。放入PCR仪70℃10min进行变性退火反应。之后继续加入反应体系：5×缓冲液（Buffer）10μL，2.5nM dNTP 2μL，Prime Script RTase 200U／μL 2.5μL，加ddH2O 至50μL，按30 ℃ 10 min，42℃60min，70℃15min的反应条件进行逆转录反应。

1.3.3 荧光定量PCR 依照说明书操作ABI 7500Real-Time PCR System，反应体系如下：Sso Fast EvaGreen supermix with low Rox 9μL，正向引物2μL，反向引物2μL，RT-PCR反应液2μL，无RNA酶的ddH2O 5μL。扩增过程如下：95℃预变性20s；95℃10s，60℃34s；扩增40个循环后进行熔解曲线分析。数据采用2-△△CT法进行分析，以阴性对照为参照进行计算。

1.4 统计学处理 用SPSS13.0软件进行统计学处理。各指标的结果采用±Sx表示，组间比较用方差分析，当方差齐时组间两两比较用LSD，当方差不齐时，组间两两比较用Dunnett′s T3，格列卫IC50的确定，采用MTT法，并参考文献［4］进行。

2 结 果

2.1 格列卫最适浓度的选择 由于本实验采用的是未经纯化处理的格列卫，因此需要重新确定其作用于K562的IC50浓度。台盼蓝染色结果显示，生理盐水以及系列浓度（10、20、30、40、50μmol／L）的格列卫作用于K562细胞，细胞抑制率结果如图1所示。MTT实验确定IC50浓度为40.85μmol／L，后续实验中格列卫的浓度选用30、50μmol／L两种浓度。

图1 不同浓度格列卫作用于K562细胞的细胞存活率（±Sx）

2.2 miR-146a、miR-29b表达水平改变 miR-146a水平在格列卫作用后显著升高（P＜0.05），miR-29b水平在格列卫作用后上升，结果见表1。

表1 格列卫作用后K562细胞中miR-146a及miR-29b表达水平改变

表2 格列卫作用后K562细胞中甲基化酶的表达水平改变

2.3 格列卫作用后K562细胞甲基化酶表达水平改变 30、50μmol／L格列卫作用后，K562细胞中甲基化酶基因mRNA的变化呈下降趋势，见表2。

3 讨 论

MiR-146a在造血及免疫反应中具有重要作用［5-7］。格列卫是特异性的BCR／ABL酪氨酸激酶抑制剂。格列卫抑制K562细胞中BCR／ABL活性后，导致系列生物学行为的改变，其中包括 NF-κB、cMyc的抑制等［8］。作为 NF-κB的下游靶基因之一，miR-146a的表达在STI571作用后却并未受到抑制。本研究在临床患者（结果未显示）及体外细胞研究中均发现，格列卫作用后，患者外周血单个核细胞中miR-146a水平无显著变化，格列卫作用于K562细胞，可使其细胞内miR-146a水平升高，与Stéphane Flamant等［9］的研究结果相互印证。但本研究选取的病例均为慢粒加速期的患者，而Stéphane Flamant等［9］的研究中纳入为初诊慢粒患者，并且均为首次接受IM治疗。Wang等［10］的研究结果显示 miR-146a的表达水平与ALL和AML患者的生存呈相反的关系，高表达miR-146a的患者临床预后相对差。但Wang等［10］的研究对象为急性白血病，与CML不可比较，无论细胞遗传学分型还是疾病的治疗方面均有显著差异。因此，本研究结果为全面理解miR-146a在CML中的调控及作用机制提供了新的证据和线索。

MiR-29b可以通过直接下调DNMT3A、DNMT3B，以及通过sp1间接下调DNMT1，从而导致大部分DNA的去甲基化，进而使得急性白血病细胞中多种肿瘤抑制基因得以重新表达［11-12］。本研究结果也显示了格列卫作用后miR-29b的水平升高。

本研究结果表明，格列卫作用后，三种甲基化酶的水平降低，结合Starczynowski等［3］对pre-miR-146a启动子区进行甲基化分析的结果，本研究认为甲基化酶水平降低是格列卫作用后miR-146a升高的原因之一，也就是说，K562细胞中甲基化酶水平升高导致miR-146a前体启动子区的甲基化，这是K562细胞中miR-146a维持在较低水平的原因之一。

在今后的实验中将继续探讨升高miR-146a对K562细胞的作用，并进一步从转录因子的结合能力等方面，探讨格列卫作用后miR-146a不降反升的可能作用机制。

［1］Kaufmann SH.Imatinib spells BAD news for Bcr／ablpositive leukemias［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（40）：14651-14652.

［2］Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF-kappaB-IN-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（33）：12481-12486.

［3］Starczynowski DT，Morin R，McPherson A，et al.Genome-wide identification of human microRNAs located in leukemia-associated genomic alterations［J］.Blood，2011，117（2）：595-607.

［4］赵斌，葛金芳，朱娟娟，等.小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法［J］.安徽医药，2007，11（9）：834-836.

［5］Wang S，Zhang X，Ju Y，et al.MicroRNA-146afeedback suppresses T cell immune function by targeting Stat1in patients with chronic hepatitis B［J］.J Immunol，2013，191（1）：293-301.

［6］Zhao JL，Rao DS，O′Connell RM，et al.MicroRNA-146a acts as a guardian of the quality and longevity of hematopoietic stem cells in mice［J］.Elife，2013，2：e00537.

［7］Yang L，Boldin MP，Yu Y，et al.miR-146acontrols the resolution of T cell responses in mice［J］.J Exp Med，2012，209（9）：1655-1670.

［8］Nakamura S，Yokota D，Tan L，et al.Down-regulation of Thanatos-associated protein 11by BCR-ABL promotes CML cell proliferation through c-Myc expression［J］.Int J Cancer，2012，130（5）：1046-1059.

［9］Flamant S，Ritchie W，Guilhot J，et al.Micro-RNA response to imatinib mesylate in patients with chronic myeloid leukemia［J］.Haematologica，2010，95（8）：1325-1333.

［10］Wang Y，Li Z，He C，et al.MicroRNAs expression signatures are associated with lineage and survival in acute leukemias［J］.Blood Cells Mol Dis，2010，44（3）：191-197.

［11］Garzon R，Liu S，Fabbri M，et al.MicroRNA-29binduces global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting directly DNMT3Aand 3Band indirectly DNMT1［J］.Blood，2009，113（25）：6411-6418.

［12］Griffiths EA，Gore SD.MicroRNA：mIR-ly regulators of DNMT［J］.Blood，2009，113（25）：6269-6270.