内皮祖细胞在治疗性血管新生中的作用及应用潜能研究进展

张春光综述，罗文军审校（重庆医科大学附属第二医院血管外科，重庆400010）

静脉血栓的溶解、机化过程与伤口愈合过程类似[1]。血栓机化初期，血栓内可观察到炎症细胞的浸润和新生内皮细胞（ECs）被覆的管腔结构，这与肉芽组织中毛细血管形成过程相似，说明血栓溶解过程中伴随有新生血管的形成。有研究表明，白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和血管内皮生长因子165（VEGF165）等促血管新生因子均可通过诱导血管新生作用加速血栓溶解、机化和再通[2]。后续研究进一步证实，从外周循环血单个核细胞中分离的骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）在缺血环境或某些生长因子作用下能够募集到生理性和病理性血管生成的特定部位，分化为成熟的ECs 继而形成毛细血管样组织，参与内皮修复并促进缺血组织的血管新生。同时，在血栓溶解过程中也发现存在大量骨髓源性EPCs。由于具备这些特征，EPCs 常被作为干预因素用于生理或病理条件下血管新生替代治疗。因此，研究EPCs 促血管新生作用，加速血栓的溶解、机化、再通，可能成为一种新的治疗策略。然而，体外诱导EPCs 分化和促使EPCs 迁移、归巢到受损血管内皮或血管外组织的相关机制以及信号传导途径尚不清楚。本文将EPCs 的来源及表型、生物学特性及促血管新生机制综述如下。

1 EPCs 的来源及表型

1997 年，Asahara[3]首次报道用磁珠从成人血液中分离纯化的、表达CD34 和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的肝星状细胞（HSCs）能在体外分化成EC 表型，并将其称为EPCs，以显示这些细胞可以表达各种内皮标记，并发现这些细胞能归巢到缺血部位，参与血管新生。1 年后Shi 等[4]的研究也得到了相同结果，并发现CD34+HSCs 能分化为EC 系细胞并表达EC 标志物血管性假性血友病因子（vWF）和荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）。这些最初的研究将EPCs 定义为能同时表达HSCs 标志CD34 和EC 蛋白VEGFR2 的一类细胞。然而，进一步的研究证实，CD34 并不只是在EPCs 上表达，其同时还在成熟的ECs 上表达，而EPCs 在骨髓中或刚移植时，如外周血表达3 种标记，即CD133、CD34 和VEGFR2[5]，在分化成熟过程中EPCs 逐渐失去CD133标记并开始表达CD31、血管内皮钙黏蛋白和vWF。CD133 也称为AC133，是一种高度保守的穿膜多肽，相对分子质量约为120×103，其生物学活性尚不清楚，可在骨髓、胎肝和外周血来源的HSCs 中表达，但不能在成熟的ECs 及单核细胞中表达。绝大多数具有CD133+/CD34+/CEGFR2+的细胞均位于骨髓中，成人脐静脉ECs 表面未能检测到CD133 的表达，而外周血成熟ECs 可高表达VEGFR2、血管内皮钙黏蛋白和vWF。循环中的EPCs 表达各种内皮标记，包括CD31、CD146、血管内皮钙黏蛋白、vWF、一氧化氮合酶、E-选择素等。因此，CD133+VEGFR2+细胞显然更适合反映未成熟的祖细胞，但也有可能是血管壁的脱落细胞。目前尚不清楚CD133 是仅代表一种表面标记，还是在血管新生调控中具有一定生物学功能。

总的来说，关于EPCs 的鉴定和起源的争论依然存在[6]。在外周血单个核细胞中，EPCs 可能存在以下来源：（1）稀少的HSCs；（2）骨髓样细胞，能够在选择性培养基中分化为ECs；（3）其他循环祖细胞；（4）循环血中从血管壁脱落的成熟ECs 等。有研究还发现，改变体外培养条件可快速转换细胞表型[7]，如在培养基中添加他汀类物质可增加ECs 克隆数量，而且连续培养可增加内皮标志蛋白的表达。一系列研究表明，除HSCs 以外的其他细胞系也可分化为ECs，因此，非骨髓源性的细胞可代替ECs 覆盖移植物。同时，成人骨髓源性祖细胞，如侧系细胞和多能祖细胞也能分化为ECs。心脏源性组织祖细胞也发现能分化为ECs，因此，EPCs的来源很难界定。

2 EPCs 促血管新生作用

促血管新生是挽救严重缺血组织的一种治疗选择。骨髓源性EPCs 能归巢到缺血部位并表达内皮标记[8]，这一研究结果对单纯利用体外分离的HSCs 或EPCs 进行治疗的方式提出了挑战。输注骨髓中分离的或体外培养扩增的不同细胞到缺血部位后可增加毛细血管密度和血管新生。Morancho 等[9]发现，将新鲜分离的人CD34+单核细胞静脉内灌注到裸鼠心肌梗死动物模型中，能减少心肌细胞凋亡并显著增加血流和改善心脏功能，减少左心室瘢痕形成。同样，EPCs 促进血管生成的作用可改善脑缺血，其中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在其过程中起关键作用[10]。

在开展的临床试验中也得到相似的结论，即骨髓源性或循环血中的祖细胞均有利于缺血组织血供的恢复[11]。在肢体缺血患者骨髓源性单个核细胞的自体移植临床试验结果也显示，患者踝肱指数明显改善，静息痛明显缓解[12]。除在肢体缺血治疗方面外，在肿瘤血管新生动物模型中也观察到EPCs 潜在的促血管新生活性，而分化成熟的ECs 却不能促进血管新生。

体外扩增的来源于CD14+或CD14-单个核细胞的EPCs 能促进血管新生，然而，新鲜分离的单个核细胞却无此功能，表明EPCs所具备的增加组织血供的功能不是来源于细胞的单个核细胞表型，而是EC 表型[13]。因此，新分离的单核细胞不适合治疗外周动脉疾病患者。但单核细胞可能在微小动脉侧支生成过程中起重要作用，MCP-1 能募集单核细胞，促进动脉生成[14-15]。这些研究均提示单核细胞对动脉生成是必需的。就治疗应用而言，单核细胞的局部应用优于系统性灌注，因为这样对机体不良反应最小。

即使在正常生理状态下，体内可利用的EPCs 的数量是非常有限的。而且在高龄、糖尿病、高脂血症、高半胱氨酸血症等病理条件下，EPCs 的功能受损更明显。基因修饰的EPCs 可弥补缺血肢体受损的血管新生能力[16]，因此，有前景的治疗策略包括通过用促血管生长因子基因修饰EPCs，增强促血管新生的细胞信号传导通路活性，长期维持EPCs 的增殖潜能及延长EPCs 的生存期。

3 EPCs 促血管新生的机制

3.1 EPCs 与血管组织结合率 尽管EPCs 促血管新生作用已被多项研究所证实，但EPCs 是如何促进血管新生的机制依然不清楚。通过研究标记绿色荧光蛋白（GFP）或β-半乳糖苷糖（lacZ）的EPCs 进行移植实验发现，在组织未受损时EPCs 结合率很低[17]，而在缺血组织中表达内皮标志蛋白的骨髓源性细胞结合率为0%～90%[18]。在卒中的研究中发现，脑血管内骨髓源性细胞结合率差异较大。Bao 等[19]和Rosell 等[20]的研究表明，平均34%的脑血管表达骨髓源性EPCs，而其他研究却未发现内皮标记细胞，其中一些研究仅测定了黏附在血管上的骨髓源性细胞而未测定其是否表达内皮标记蛋白。这些结果提示，组织缺血状态可显著影响EPCs 结合率[21]。轻微缺血并不能诱导骨髓源性EPCs 的动员，只能引起少量EPCs 的参与。 相对于内源性动员的骨髓源性EPCs，经静脉内灌注体外纯化的骨髓源性单个核细胞或扩增的EPCs均可诱导更高的结合率[22]。

然而，有研究发现，结合到缺血组织的细胞中具有内皮表型的细胞数量却很少。这些微量的具有EC 表型的EPCs 诱导血管新生的机制尚不明确。一种可能的解释是血管新生不是单独依赖结合的EPCs，同时，受到分泌的促血管生成因子的刺激，EPCs 可能与单核细胞及巨噬细胞相似，可以通过分泌细胞因子和生长因子促进动脉生成[23]。通过不同来源培养的EPCs 均可表达各种生长因子，如VEGF、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等。而且，相同条件下培养的单核细胞虽然不能表达内皮标记蛋白，但可释放VEGF、HGF 和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），这些因子反过来又可促进成熟ECs 增殖、迁移和存活，进而影响血管生成过程[24]，这一过程又可诱导更多的EPCs 结合到新生成的血管结构中，并表达内皮标记蛋白。相反，单独灌注可以释放生长因子的巨噬细胞到体内，由于其不能结合到血管样结构中，因此，其诱导的血管新生作用非常微弱。

3.2 EPCs 的募集与动员 EPCs 从骨髓中动员是由局部微环境决定的，又称为“祖细胞微生态”，这一过程受成纤维细胞、成骨细胞和ECs 相互作用和一系列生长因子、酶、配体、受体所调控。各种细胞因子通过妨碍EPCs 和间质细胞间的连接，使得EPCs 通过跨内皮迁移离开骨髓产生动员效应。各种蛋白酶，如弹力蛋白酶、组织蛋白酶G 和MMPs 的活化可裂解间质细胞间连接，并与HSCs 上的整合素相结合而发挥作用。MMP-9 活化后可裂解膜连接kit 配体，并释放可溶性kit 配体,促进定向HSCs 和成血管细胞移动至骨髓中的血管区[25]。但启动成血管细胞转变为定向HSCs或EPCs 的信号传导通路尚不清楚，目前认为，是促血管生长因子产生的重要作用，如肢体缺血及冠状动脉血栓形成、烧伤或冠状动脉搭桥术后引起的血管壁损伤被认为可能是诱导EPCs 从骨髓动员最突出的信号。 缺血可以上调VEGF 或基质细胞衍生因子-1（SDF-1）水平，二者依次释放入血，可通过MMP-9 诱导EPCs从骨髓中动员，从而快速增加循环系统中EPCs 数量，而且，用编码VEGF 的质粒进行基因治疗的临床研究也证明，能达到增加外周血中EPCs 数量的目的。

从外周血收集HSCs 进行骨髓移植实验的过程中，发现G-CSF可增加循环中EPCs 水平，目前已用于在患者体内动员CD34+细胞。另一个因子，粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）也可增加EPCs 数量，此外，红细胞生成素（EPO）同样可增加人和小鼠外周血EPCs 数量[26]。目前并不清楚是否所有动员因子均可提高EPCs水平。在动物模型中，SDF-1 及VEGF165 效果相似，均能快速动员HSCs 和循环中的内皮前体细胞，相对而言，血管生成素1 的动员作用要延迟和微弱得多。应用G-CSF 可增加白细胞数量，但ECs克隆组较VEGF、SDF-1 处理组弱，这可能是由于不同小鼠品系对细胞因子的反应不一所致。

促进EPCs 动员的因素不仅包括促造血或促血管生成的各种刺激，还包括多种重组药物。体外研究及小鼠和人体内研究发现，他汀类药物可增加EPCs 数量和功能[27]，其机制在于他汀类药物可快速活化EPCs 中蛋白激酶B（Akt）信号通路。除他汀类药物外，EPCs 数量增加和功能增强的机制还包括EPCs 的增殖、迁移、抗衰老和抗凋亡。最近研究表明，雌激素也可增加循环中EPCs 的水平[28]。

迄今，分子信号传导途径仍然未阐明，磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶（PI3K）/Akt 旁路途径是他汀类药物活化成熟ECs 的最早途径。一系列的研究提示，该途径的激活与他汀类药物诱导EPCs 募集作用有关[29]。此外，EPO、VEGF、雌激素和功能训练等均可增强PI3K/Akt 旁路，使得这些因素均可共享相同的信号途径。最新研究表明，内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）也是骨髓源性祖细胞动员所必需的。有学者推测，这些刺激也能通过活化骨髓间质细胞内PI3K/Akt 依赖性一氧化氮合酶来实现。

3.3 EPCs 的归巢与分化 在早期研究脐血来源的胚胎EPCs 归巢实验中发现，循环血细胞可停滞于微血管中，并侵入间质结合到新生血管表面。提示EPCs 归巢至血管新生部位涉及细胞黏附和迁移过程[30]。因此，可设想体外扩增的成人EPCs 和HSCs 也能通过相同途径归巢到缺血部位，参与血管新生。EPCs 的归巢涉及多个步骤及大量黏附信号途径协同参与，如化学诱导、黏附、迁移等，最终分化为ECs。

EPCs 分化为成熟ECs 的过程对血管构成至关重要，而且，当血栓性微血管病或球囊损伤后，EPCs 能通过分化参与受损内皮的修复。但目前尚不清楚哪些因素能影响其归巢与分化。有研究显示，部分EPCs 甚至可能在转化生长因子β1作用下转分化为平滑肌细胞[31]。然而，体内EPCs 转变为成熟ECs 的具体时间节点仍不清楚。有学者认为是在失去CD133 表型，并开始表达vWF 等内皮标志时；也有研究表明，分化过程的启动点可能是EPCs 从骨髓动员入外周循环时，待成熟血管ECs 黏附并结合到单层血管内皮后至分化过程结束。成体EPCs 分化调控的具体遗传学机制尚不清楚。

3.4 EPCs 的黏附与跨内皮迁移 祖细胞归巢到缺血组织的第一步包括缺血激活EPCs 黏附到ECs 及EPCs 跨内皮迁移。整合素可介导各种细胞的黏附，包括将HSCs 和粒细胞黏附到细胞外基质或内皮细胞上[32]。β1整合素可在ECs 和造血细胞等多种细胞中表达，而β2整合素主要在造血细胞中表达。由于体内祖细胞归巢到活化的血管新生组织的过程涉及ECs 的黏附与跨细胞过程，因此，β2整合素和α4β1整合素可能参与了EPCs 的归巢过程。Bowden 等[33]研究发现，β2整合素在外周血源性EPCs 上表达明显上调，而且其参与了EPCs 黏附到ECs 与跨内皮迁移过程，β2整合素缺乏可导致HSCs 归巢和血管新生的能力明显减弱。有趣的是，在β2整合素敲除的小鼠肺炎和心肌缺血模型中，炎症细胞的归巢能力可以由α4β1整合素介导，提示β2整合素的缺乏可由α4β1整合素部分补偿[34]。而且，条件性删除α4β1整合素可选择性抑制HSCs归巢到骨髓，表明祖细胞归巢到不同组织是由不同黏附分子介导的。此外，体外研究表明，抗β1整合素抗体可阻止MCP-1 介导的骨髓源性CD34-/CD14+单核细胞黏附至内皮。有趣的是，外周血源性CD34-/CD14+单核细胞的这种黏附能力受MCP-1 影响极小且不能被抗β1整合素抗体阻止[35]。所以，不同细胞类型归巢到不同血管新生部位是通过不同机制实现的。

细胞间相互作用与跨细胞过程对裸露动脉的内皮修复并不重要。就EPCs 而言，研究集中于整合素对内皮修复的作用，主要是由与细胞外基质蛋白的黏附来控制的。EPCs 黏附到裸露血管可能是由玻连蛋白受体（αvβ3整合素和αvβ5整合素）介导的。因此，通过体内用RGD 肽抑制αvβ3整合素和αvβ5整合素封闭裸露动脉内皮修复过程的实验提示，αvβ3整合素和αvβ5整合素涉及受损颈动脉内皮修复过程[36]。

3.5 EPCs 趋化、迁移与侵入 考虑到循环中祖细胞数量极其稀少，因此，化学诱导在祖细胞募集到缺血或受损组织过程中起重要作用。多种研究测定了趋化HSCs 进入骨髓的不同细胞因子，这些因子包括SDF-1、脂质介导素及异种细胞释放因子。事实上，SDF-1已经被证实可促进祖细胞募集到缺血组织。在诱导心肌梗死第1天SDF-1 明显升高，而且SDF-1 过表达可增强祖细胞归巢[37]。HSCs对SDF-1 异常敏感而对G-CSF 或其他炎症趋化因子[如IL-8 和肿瘤坏死因子（TNF）]无反应。而且VEGF 在缺血时浓度增加也能成为EPCs 的趋化因子。而VEGF 或SDF-1 对EPCs 或骨髓细胞的迁移作用决定了患者祖细胞治疗后的功能改善。除缺氧后上调的基因外，缺血组织中免疫活性细胞的侵入也可增加各种趋化因子（如MCP-1、白介素）的浓度，这些因子同样可吸引循环汇总的祖细胞。然而，大量研究仅关注了介导EPCs 归巢至缺血组织的调控机制，而少有研究关注迁移与组织侵入。有学者推测，蛋白酶，如组织蛋白酶或基质蛋白酶可能介导EPCs 的组织侵入过程。

4 小 结

灌注不同的HSCs 或体外扩增的EPCs 均可促进缺血后组织的血管新生，这提供了一种全新的治疗选择。但仍然有诸多问题尚未解决，其中复杂的问题包括如何定义EPCs 问题，目前比较一致的意见是EPCs 来源于骨髓表达的CD133/VEGFR2，然而不断有证据显示，血液中存在的其他骨髓源性的细胞系也能分化为ECs。而且外周血中还可分离出具有ECs 特征的非骨髓源性细胞，表明存在的脱落成熟ECs 或其他ECs 可能源于其他祖细胞系。最近研究还表明，EPCs 相对于成熟ECs 对促血管生长因子具有更强的反应性和存活性。从治疗角度而言，祖细胞的这些功能活性比其来源更重要。其他问题包括灌注的EPCs 促进血管新生的机制问题，很可能除物理渗入外还存在内分泌效应等。

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