产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

□林 谦，廖珊珊

（玉林师范学院 生命科学与技术学院，广西 玉林 537000）

产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

□林 谦，廖珊珊

（玉林师范学院 生命科学与技术学院，广西 玉林 537000）

从多种酸菜水中分离筛选出乳酸菌，利用乳酸菌将谷氨酸转化为GABA的脱羧作用，通过混合酸碱指示剂颜色变化，直观判断谷氨酸脱羧酶(GAD)活性，进而筛选出产GABA乳酸菌菌株BL2，并对其进行初步鉴定；同时，采用纸层析法进行定性分析，确定菌株BL2可将谷氨酸钠转化生成GABA.

乳酸菌；γ-氨基丁酸；筛选

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）又名4-氨基丁酸(4-aminobutanoic acid，4-AB)、γ-氨酪酸，是一种非蛋白质天然氨基酸，分子式为C4H9NO2.GABA是中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，具有降低血压、改善脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫痫、活化肾肝、促进精子受精等功能[1].由于GABA具有多种生理功能，生产富含GABA的保健食品成为了食品工业的研究热点.一般来说，GABA是从L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(GAD)催化脱羧生成的.GAD是生物体内合成GABA的关键酶.国际上对大肠杆菌的GAD研究最为深入，但大肠杆菌对人体具有潜在的致病性，不适合用于食品级GABA的生产.由于乳酸菌长期应用于食品工业，具有安全的优势，筛选能够高产GABA的乳酸菌得到了广泛重视.本文从玉林本地的发酵蔬菜中筛选具有GABA合成能力的乳酸菌，旨在为利用乳酸菌发酵生产富含GABA的降血压功能食品打下基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株来源：玉林市东岳市场出售酸白菜(发酵约8天左右)，自制酸萝卜(发酵约15天左右)，玉林市龙船市场出售酸辣椒(发酵约7天左右)，玉林市龙船市场出售酸大蒜(发酵约10天左右).试剂为分析纯和生化试剂.

试验仪器：LRH-100生化培养箱，韶关泰宏医疗器械公司；THZ-98C恒温振荡器，上海一恒科学仪器公司；TU1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；H1850R高速冷冻离心机，湘仪离心机公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器BXM-30R，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子分析天平FA2004，上海舜宇恒平仪器厂.

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO42 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，H2O 1000 mL，pH 6.5.115 ℃灭菌20 min.

乳酸菌筛选培养基：MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，乙酸钠0.5 g，MnSO4·4H2O0.01 g，酵母膏5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NaCl 0.01 g，CaCO320 g，琼脂15 g，1.6 %甲酚紫溶液1.4 mL，H2O 1000 mL，pH 5.8-6.0.121℃灭菌25 min（调好pH值后加入1.6 %甲酚紫溶液，CaCO3单独灭菌待培养基冷却至50℃左右时加入.）

脱脂乳培养基：取少许碳酸钙加入，配12 %脱脂乳分装于试管，每管5 mL，115℃灭菌10分钟.

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的初筛

从酸菜水中取样3 mL，加入至150 mL的MRS液体培养基中，37℃活化静置培养24 h，在无菌操作下，对发酵后的液体进行10倍浓度梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9七个浓度梯度，分别涂布于筛选培养基上，置于37℃的恒温箱中培养48 h，挑取有溶钙圈的菌落.

1.2.2 乳酸菌的保存

将筛选出的乳酸菌于MRS液体培养基培养12 h后取1 mL转入脱脂乳培养基，静置培养至培养基凝固，不再流动，放入4℃保存2周.

1.2.3 产GABA乳酸菌的筛选及鉴定

取3 mL在脱脂牛乳中保存的乳酸菌接入MRS培养基，于37℃静置培养12 h后，然后取3 mL培养液接入MRS培养基，于37℃静置培养12 h，如此重复3次.再吸10 mL培养液接入MRS培养基，于37℃静置培养12 h.

将筛选出的乳酸菌各取10 mL乳酸菌发酵液离心（5000转，30 min）收集菌体，用0.9% NaCl溶液洗涤菌体再离心收集菌体，重复3次.在菌体中加入大约10倍的1% MSG溶液（即1 %谷氨酸钠），用0.1%HCl调节pH 4.7，37℃反应12 h，离心（5000转，30 min），收集上清液.在上清液中加入2-3滴混合酸碱指示剂，观察颜色变化.取颜色变绿的乳酸菌，进行形态观察、生化试验等鉴定[2]，发酵液中GABA的分析参照以下步骤.

1.2.4 GABA的定性分析

取滤纸，高约15 cm，宽度以样品数量而定.取培养液1 mL离心（5000转，10 min），取2 μL上清液点样，于密闭容器中进行.展开剂为：正丁醇：冰醋酸：水=5:3:2（V/V/V）展开剂含1.2 %的茚三酮.当展开至滤纸前沿上端1 cm左右时取出，放置80℃烘箱中烘烤15 min，观察斑点.以5 g/L谷氨酸钠和5 g/ LGABA标准品作为对照.

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

用乳酸菌分离培养基对酸白菜（A）、酸萝卜（B）、酸辣椒（C）、酸大蒜（D）四个样品进行筛选分离，初步分离出69株单菌落，选取可产酸使溴甲酚紫指示剂由紫变黄，溶钙圈明显，生长良好的菌株，如图1.根据四个样品菌落的不同特征，每个样品分别选取两株菌落特征较为明显的菌株，即从A中挑取的菌株编号为AL1、AL2，从B中挑取的菌株编号为BL1、BL2，从C中挑取的菌株编号为CL1、CL2，从D中挑取的菌株编号为DL1、DL2.各菌株形态特征如表1所示.

图1 乳酸菌的分离Fig 1 Isolation of lactic acid bacteria

表1 筛选培养基上各菌株形态特征Table 1 Physiological characteristics of LAB strains

2.2 产GABA乳酸菌的筛选

取BL2、CL2、DL1、DL2的乳酸菌发酵液离心、洗涤后，加入1 %MSG溶液，调pH 4.7，培养24小时取上清夜，滴加酸碱指示剂，观察颜色变化(图2).

图2 产GABA乳酸菌的筛选Fig 2 Screening of GABA-producing LAB

BL2反应液变绿说明BL2产GABA，CL2、DL1、DL2呈紫色，则CL2、DL1、DL2不产GABA.取BL2菌株继续以下实验.

2.3 BL2的形态观察与鉴定

通过形态观察与生理生化鉴定，BL2为革兰氏阳性，杆状、单个排列；无芽孢，不运动微耗氧细菌；BL2可利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、进行发酵使培养基由紫变黄，且不产气；无色氨酸酶、过氧化氢酶，不使吲哚变色，为吲哚实验阴性；不使过氧化氢分解产气，为接触媒实验阴性.可初步鉴定BL2菌株为乳杆菌属细菌[3].

2.4 发酵液中GABA的定性分析

图3 纸层析Fig 3.11 Analysis of GABA by paper chromatography

将菌体转化谷氨酸钠的反应液取上清点样，纸层析结果如图3所示，BL2转化液样品出现与标准品GABA处于同一直线的斑点，即样品与标准品GABA的Rf值大致相同，可判断出BL2乳酸菌将谷氨酸钠转化成了γ-氨基丁酸.

3 讨论

从自然发酵泡菜中筛选出了产GABA乳酸菌株BL2，说明了从自然界筛选产GABA乳酸菌是可行的.由于试验条件和时间限制，本实验范围较窄.但试验所确定的筛选方案可为以后筛选产GABA乳酸菌提供参考.

本实验主要是以传统的表型特征和生物学特性为依据，对筛选到的产GABA乳酸菌BL2进行了鉴定和分类，初步将该菌株鉴定为乳杆菌属细菌.但这种传统分类鉴定有局限性，未能深入确定所筛选出菌种名称.

本实验采用纸层析法对发酵液中的GABA进行定性分析，此种方法简单易行，多种展开剂配比后，确定展开剂的配方为正丁醇：冰醋酸：水=5:3:2（V/V/V）时GABA较易与其他氨基酸分离. ■

[1]杨胜远，陆兆新，吕凤霞，等. γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展[J]. 食品科学，2005，26（9）：546-551.

[2]周德庆. 微生物学实验教程(第2版)[M]. 高等教育出版社，2006.

[3]凌代文,东秀珠. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京：中国轻工业出版社，1999.

【责任编辑 谢文海】

Screening of Lactic Acid Bacteria for Synthesis of γ-Aminobutyric Acid

LIN Qian, LIAO Shan-shan
(College of Life Science and Technology, Yulin Normal University, Yulin, Guangxi 537000)

LAB Strains were isolated from pickled vegetable juice. Since glutamate acid decarboxylase of LAB can convert monosodium glutamate toγ-aminobutyric acid, color changes of transformation system supplemented with acid-base indicator facilitate screening of GABA-producing LAB. Strain BL2 was isolated and identified. Analysis of paper chromatography suggested the strain’s ability to produce GABA.

lactic acid bacteria; γ-aminobutyric acid; screening

Q939.9

A

1004-4671（2014）05-0050-04

2014-06-10

广西自然科学基金（2011GXNSFB018046）；广西高校特色专业及课程一体化建设项目（GXTSZY220，GXTSZY022）。

林谦(1977～)，男，玉林师范学院生命科学与技术学院副教授，博士，研究方向：微生物学、基因工程教学与研究。