超临界CO2萃取白簕叶总黄酮工艺的研究

陈耿廷，黄东燕，黄俊生

（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）

超临界CO2萃取白簕叶总黄酮工艺的研究

陈耿廷，黄东燕，黄俊生*

（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）

采用超临界CO2萃取白簕叶中的总黄酮化合物，通过单因素试验和正交试验，研究了超临界萃取条件（压力、温度、时间、CO2流量）对其总黄酮的影响．实验结果表明，最佳提取条件：萃取压力20 MPa，萃取温度35℃，萃取时间1 h，CO2流量20 L/h．白簕叶总黄酮提取值为2.929 mg/g.

超临界萃取；总黄酮；白簕；正交试验

白簕（Acanthopanax trifoliatus（L．）Merr．），又称苦刺、三加皮、鹅掌、三叶五加，为五加科（Araliaceae）攀援状灌木，白簕全株均可入药，味苦、辛、凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋、止咳平喘之功效．主要分布于我国华南、西南、华中等地区，印度东北至印度支那、日本和菲律宾也有分布，生于林缘、灌丛或山坡上[1-3].黄酮类化合物具有多种生物活性，主要表现为清除自由基、抗癌作用、抗突变作用、免疫增强等作用[3]，而白簕叶的黄酮含量较为可观，如何充分利用这一资源大量制备生物活性黄酮将会具有十分重大的经济价值和现实意义.

目前提取植物类黄酮，主要采用醇类萃取技术．笔者以白簕叶为材料，采用CO2超临界萃取技术[4-5]，进行了提取尝试，以期为工业大量生产的技术改进提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白簕（采自韩山师范学院）；芦丁；蒸馏水；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为分析纯．

1.2 仪器与设备

HA120-50-01超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司）；LGJ-10B冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；Spectrumlabt722sp可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂）；FA2004N电子天平；RE52-05旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DGG-9070BD型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；JF⁃SD-100-Ⅱ粉碎机（上海嘉定粮油仪器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将自然阴干的白簕叶粉碎，过40目筛，置于锥形瓶中，加入石油醚（2 mL/g）脱脂、脱色2 h，重复几次，至石油醚层几乎无色，倾去浸提液，样品置于通风处干燥备用.

1.3.2 芦丁标准曲线及回归方程的建立

1.3.2 .1芦丁标准溶液的制备

称取芦丁20.00 mg，用95%乙醇，于37℃水浴中加热使之溶解，并定容至100 mL，即可制得芦丁标准溶液，每1.0 mL溶液中含有芦丁0.2 mg.

1.3.2 .2标准曲线的绘制

用移液管分别吸取芦丁标准液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL转移至编号为0、1、2、3、4、5、6的25 mL的容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.5 mL摇匀，静置5 min后再往各容量瓶中加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL摇匀后，静置5 min后加入4%NaOH溶液5 mL，用95%的乙醇溶液定容至25 mL摇匀，静置15 min，然后用紫外-可见分光光度法，在510 nm的波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线（见图1），得标准曲线回归方程A=10.913C+0.0025，r2=0.9995．式中：C——芦丁浓度（mg/mL），A——吸光度，表明在0.008-0.04 mg/mL浓度范围内线性良好.

图 1 芦丁标准曲线

1.3.3 提取方法和实验设计

称取5.00 g白簕叶干燥粉末，置于萃取釜中，按照试验设计要求的工艺条件，加入一定量的夹带剂，设定萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量，进行超临界CO2提取．收集萃取液并测定其中黄酮的含量．

采用单因素试验，分别考察萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量四个因素对白簕叶总黄酮提取量的影响．并设计L9（34）正交试验，通过极差分析与方差分析，确定超临界流体萃取白簕叶总黄酮的最佳条件.

1.3.4 提取物中黄酮含量的测定

以芦丁为对照品测定白簕叶提取物中黄酮的含量．各提取物用95%乙醇定容于50 mL容量瓶中，精密吸取其中5 mL置于50 mL容量瓶中．按标注曲线绘制方法对样品溶液进行处理，测得各样品溶液的吸光度后根据标准曲线计算出各溶液中黄酮的含量．

2 结果与分析

2.1 超临界CO2萃取白簕叶总黄酮中各种操作参数的影响

2.1.1 压力对总黄酮提取效果的影响

取白簕叶粉末5.00 g，分别以不同的萃取压力（15、20、25、30、35 MPa）各自在萃取温度35℃、夹带剂无水乙醇35 mL、CO2流速20 L/h的条件下萃取1 h，分析测定总黄酮提取量．随着萃取压力的增大，总黄酮提取量呈不断增加的趋势．当压力为20 MPa时，提取量达到最大．之后随着压力的增加，总黄酮提取量逐渐降低．这是因为随着压力的升高，超临界CO2流体的密度逐渐增加，溶质与溶剂之间的传递效率增加，使细胞内的物质更容易传递到细胞的表面，使萃取更完全[6]．但当压力达到20 MPa后，随着压力的增大，原料粉末压缩得更紧密，总黄酮溶出受阻，导致提取量下降．试验结果表明，萃取压力为20 MPa时总黄酮提取量最大.

图 2 压力对白簕叶总黄酮提取量的影响

2.1.2 温度对总黄酮提取效果的影响

取白簕叶粉末5.00 g，分别以不同的萃取温度（32、35、40、45、50℃）各自在萃取压力20 MPa、夹带剂无水乙醇35 mL、CO2流量20 L/h的条件下萃取1 h，分析测定总黄酮提取量．萃取温度对提取效果具有双重的影响．温度升高有利于溶质挥发性的增大，提高物料的扩散系数，有利于黄酮类化合物的浸出．但同时又会降低CO2的浓度，减少CO2的密度，致使溶解能力的降低，对提取不利[7]．数据分析表明，萃取温度32℃升到35℃，总黄酮提取量呈现递增的趋势．当温度到达35℃时，黄酮提取量最大．导致温度高于35℃时，超临界发生了变化，黄酮类物质含量有所下降[8-9].

图 3 温度对白簕叶总黄酮提取量的影响

2.1.3 时间对总黄酮提取效果的影响

取白簕叶粉末5.00 g，分别以不同的萃取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）各自在萃取压力20 MPa、萃取温度35℃、夹带剂无水乙醇35 mL、CO2流量20 L/h的条件下萃取，分析测定总黄酮提取量．分析数据可知，随着萃取时间的增加，萃取所得的总黄酮增多．萃取1 h后，总黄酮的提取量无明显的增大．考虑到随着萃取时间的增加，超临界萃取的能耗增大．故后续试验的萃取时间取为1 h.

图 4 时间对白簕叶总黄酮提取量的影响

2.1.4 CO2流量对总黄酮提取效果的影响

取白簕叶粉末5.00 g，分别以不同的CO2流量（10、15、20、25、30 L/h）各自在萃取压力20 MPa、萃取温度35℃、夹带剂无水乙醇35 mL的条件下萃取1 h，分析测定总黄酮提取量．CO2流量影响总黄酮的提取．CO2流量愈大，萃取的速率愈快；CO2流量愈小，萃取的速率愈慢．从图5可见，CO2流量从10 L/h增加到20 L/h，总黄酮提取量明显增加．但当超过20 L/h以后，提取量稍有降低．这可能是因为流量过大，物料与流体的接触不充分，不利于分离器中萃取物与CO2的分离．采用CO2流量为20 L/h最佳．

图 5 CO2流量对白簕叶总黄酮提取量的影响

2.2 超临界CO2萃取白簕叶总黄酮的正交试验分析

采用L9（34）正交设计进行试验，以提取的黄酮总量为指标来确定最佳提取条件．各因素及水平设计见表1，正交试验设计见表2.

从直观和方差分析（见表3）可知，四种因素影响的主次是：萃取时间＞萃取温度＞萃取压力＞CO2流量．提取白簕叶总黄酮的最佳工艺为A2B2C2D2，即以5 g白簕叶在萃取压力为20 MPa、萃取温度为35℃、CO2流量为20 L/h的条件下萃取1 h.

表1 正交实验因素及水平

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析

2.3 验证试验

采用极差分析确定的工艺条件进行验证试验，得到白簕叶总黄酮的平均提取量为2.929 mg/g．高于正交试验中所有组合的提取率，证明其确实为超临界提取白簕叶总黄酮的最佳条件.

3 结论

（1）目前，采用超临界二氧化碳萃取对白簕叶中总黄酮的提取研究未见报道．本文采用超临界二氧化碳萃取萃取白簕叶中的总黄酮．通过L9（34）正交试验确定了提取的最佳工艺条件．方差分析表明，最佳的提取条件为：萃取压力20 MPa，萃取温度35℃，萃取时间1 h，CO2流量为20 L/h，白簕叶总黄酮提取值为2.929 mg/g．

（2）各因素对总黄酮提取量的影响程度为萃取时间＞萃取温度＞萃取压力＞CO2流量．萃取时间和萃取温度对总黄酮的提取影响较为显著．

（3）本实验所采用的超临界流体萃取技术，萃取速度快，提取效率高，流程简单，对提高野生白簕叶黄酮的利用具有一定的参考价值．

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Extraction Technology of Total Flavonoids in Acanthopanan Trifoliatus Merr by Supercritical Carbon Dioxide

CHEN Geng-ting,HUANG Dong-yan,HUANG Jun-sheng
（Department of Chemistry,Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong,521041）

Using supercritical CO2extraction of general flavone compounds in the leaves of Acantho⁃panax trifoliatus,by single factor test and orthogonal test,the supercritical extraction conditions(pressure,tem⁃perature,time and CO2flow rate)of the effects of general flavone are studied.The experimental results show that the optimum extraction conditions:20 MPa extraction pressure,extraction temperature 35℃,1 hour ex⁃traction time,CO2flow 20 l/h.Validation experiments show that the flavonoids extraction in Acanthopanax trifo⁃liatus leaves as:2.940 mg/g,to prove that the conditions for the optimum extraction conditions.

supercritical fluid extraction；general flavone；the leaves of Acanthopanan trifoliatus Merr；orthogonal test

TQ041

A

1007-6883（2014）06-0069-06

责任编辑 朱本华

2014-06-11

陈耿廷（1991-），男，广东普宁人，韩山师范学院化学系2010级在读学生．黄俊生为通讯作者．