能抑制引起泡菜“生花”腐败菌的乳酸菌的筛选

敖晓琳，蒲 彪，蔡义民，陈 岑，胡爱华，陈安均（.四川农业大学，食品学院，四川雅安6504；.日本国际农林水产研究中心，日本茨城305-8686）

能抑制引起泡菜“生花”腐败菌的乳酸菌的筛选

敖晓琳1，蒲 彪1，蔡义民2，陈 岑1，胡爱华1，陈安均1
（1.四川农业大学，食品学院，四川雅安625014；2.日本国际农林水产研究中心，日本茨城305-8686）

从优质泡菜水中分离出的7株乳酸菌用于对引起泡菜生花的4种腐败菌进行抑菌实验，通过牛津杯法、液体培养（产膜、沉淀、液体混浊度），以及乳酸菌的发酵上清液对腐败菌抑菌率的测定，筛选出具有较强抑制4种腐败微生物生长和代谢的菌株SCP53（Lactobacillus plantarum）。将乳酸菌SCP53与腐败菌共同接种发酵萝卜，结果证实该菌株确实能起到抑制泡菜生花，改善泡菜品质的作用。

泡菜，乳酸菌，腐败菌，抑菌能力，筛选

泡菜以酸、香、脆、嫩的特点受到广大消费者的喜爱。在泡菜的生产过程中，由于蔬菜原料不容易灭菌，残留的有害微生物常引起泡菜的腐败变质。“生花”是最常见的腐败现象之一，泡菜一旦生花，不仅表面会出现白膜，而且会伴随着馊臭味或腐败味，菜品软烂，泡菜汁浑浊。本实验室前期研究已证实引起泡菜“生花”的微生物主要为酵母菌和芽孢杆菌，其中Pichia manshurica和Candida tropicalis在酸性条件下容易形成膜，是导致泡菜在贮藏过程中生花的主要微生物，而芽孢杆菌若在发酵前期污染严重，常导致泡菜样品色变、汤汁浑浊，促进生花现象的发生[1]。生产厂家常通过灭菌和添加防腐剂的办法来控制腐败菌的生长。但是灭菌通常会使泡菜变软，而添加防腐剂不仅会将乳酸菌部分杀死，而且会影响泡菜的整体风味[2]。大多数学者都是通过外来添加物来抑制发酵蔬菜中生花腐败菌的生长，例如韩国的学者通过添加大蒜油来抑制韩国泡菜中酵母菌的产膜，美国的学者通过添加（E）-3-已烯酸和已酸来取代山梨酸抑制泡菜水中酵母菌的生长[3-4]。而通过乳酸菌的生长代谢抑制引起“生花”的腐败菌的研究较少。

乳酸菌是引起泡菜良性发酵的主要微生物，在泡菜发酵过程中起着主导作用。优良的乳酸菌可通过自身的生长繁殖以及代谢产物（有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素等）的作用来抑制腐败菌的生长和代谢，而“生花”现象主要是腐败菌在有氧条件下的代谢产物所导致[4]，因此通过筛选具有抑制引起泡菜生花腐败菌的乳酸菌菌株，可以控制泡菜生花现象的发生，改善产品品质，延长商品的货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌（7株） 分离自四川自然发酵的优质泡菜样品[6]，菌株编号分别为：SCP09（Lactobacillus brevis）、SCP15（L.plantarum）、SCP21（L.plantarum）、SCP27（L.fermentum）、SCP49（L.plantarum）、SCP53（L. plantarum）、SCP57（L.plantarum），NCBI登陆号为AB617645-AB617651；腐败菌（4株） 1P-1、4P-2、3P-1、1P-2，经菌种鉴定分别为Pichia manshurica、Candida tropicalis、Bacillus subtilis、Bacillus altitudinis[1]；PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基 用于腐败真菌的活化、培养和计数；NA（营养琼脂）培养基 用于腐败细菌的活化、培养和计数；MRS培养基 用于乳酸菌的活化和培养；其余试剂 为分析纯。

PYX-DHS-60×75型电热恒温培养箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；pH4-C+型酸度计 成都世纪方舟科技有限公司；SW-CJ-1F型单人双面超净工作台 苏州净化设备有限公司；SYQ-DSY-280B型高压灭菌锅 上海善志仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌上清液的制备 乳酸菌经活化后，按0.1%的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h，8000r/min，离心1min，取上清液备用[7]。

1.2.2 指示菌菌液制备 将供试腐败菌反复三次接种到相应的液体培养基中活化后，细菌和酵母菌均按0.1%的接种量分别接种到营养肉汤和马铃薯葡萄糖液体培养基中，细菌37℃，酵母菌28℃培养24h，调整菌体浓度为108CFU/mL备用。

1.2.3 抑菌圈的测定（牛津杯法） 将配制好的琼脂空白培养基倒入灭菌的平板，每个10mL，待培养基凝固后；移取指示菌菌液至45℃的PDA（酵母菌）或NA（细菌）培养基，使菌液浓度为105CFU/mL，混匀，取15mL培养基倒入铺有空白琼脂的平板中。用镊子将已灭菌的牛津杯（内径6mm）放入平板对称四个点上，用移液枪向牛津杯中加入乳酸菌上清液50μL，牛津杯中加入MRS液体培养基作为对照，细菌37℃，酵母菌28℃恒温培养箱中培养48h，记录抑菌圈的大小。将抑菌能力较强的菌株用于后续抑菌效果和抑菌率的测定[8]。

1.2.4 乳酸菌上清液对腐败菌抑菌效果的测定 将指示菌按照0.1%的接种量接种到马铃薯葡萄糖液体培养基或营养肉汤培养基中，分装5mL于灭菌的试管中，分别加入500μL各种乳酸菌上清液作为实验组，以加入MRS液体培养基的试管作为对照，28℃或37℃恒温培养24h后观察指示菌在试管中的生长现象（产膜，混浊度，沉淀）。

抑菌率的测定：将观察现象后的培养液经梯度稀释至10-2～10-6后，涂布于PDA或NA平板中，用于测定培养液指示菌的含量，以计算不同乳酸菌上清液对不同指示菌的抑菌率。抑菌率的计算公式[9]：

抑菌率（%）=（对照组指示菌菌落数-实验组指示菌菌落数）/对照组指示菌菌落数×100

1.2.5 筛选出的乳酸菌在泡菜发酵过程中的抑菌能力 将筛选出的具有明显抑菌作用的菌株与一种腐败菌共同接种于自然发酵的泡菜样品中，只接种腐败菌的样品作为对照，用于测试乳酸菌在泡菜环境中抑制相应腐败菌的能力。

操作流程：将新鲜水萝卜清洗、晾干、切分之后称重，每100g样品加入150mL无菌水，加入总量4%的食盐后，实验组接种乳酸菌和一种腐败菌各103CFU/mL，对照组只接种相应的腐败菌103CFU/mL，密封。样品于25℃条件下发酵1周。结果记录主要包括生花程度、颜色、发酵液浑浊度。

2 结果与分析

2.1 牛津杯法测定乳酸菌对腐败菌的抑制结果与分析

从表1乳酸菌对腐败菌的抑制结果来看，供试7株乳酸菌对芽孢杆菌3P-1和1P-2抑菌效果较好，均能产生不同程度的抑制。乳酸菌SCP53和SCP27产生的抑菌圈最大，因此两株菌能有效抑制供试腐败芽孢杆菌的生长，其次抑制效果较佳的为菌株SCP21。从对酵母菌1P-1和4P-2的抑制效果来看，多数乳酸菌对这两株菌不具有抑制能力，只有乳酸菌SCP27和SCP53对其有一定的抑制能力，而SCP21只对4P-2有一定的抑制作用。

多数乳酸菌的抑菌能力来自于其产生的乳酸。产酸能力强的乳酸菌通常具有很好的抑制杂菌生长的能力，尤其是对耐酸性不强的菌株。对于芽孢杆菌而言，虽然其生命力旺盛，不容易被彻底除去，但是其在酸性条件下的存活能力大大下降[10]。供试乳酸菌全为乳酸杆菌，都具备较强的产酸能力，尤其是植物乳杆菌的产酸能力在乳杆菌中是较强的，是蔬菜发酵过程中最常用的菌株种类，所以体现出对芽孢杆菌较强的抑制效果。然而对于酵母菌而言，虽然供试的酵母菌分属毕赤酵母属和假丝酵母属，但是都能在酸性条件下生存，是酸性产品中的主要腐败微生物，能分解乙醇、乳酸、醋酸为二氧化碳和水，因此仅靠乳酸菌产酸是很难将酵母菌大量抑制的[11]。有些乳酸菌能产生H2O2、双乙酰或抑菌素类物质，可能对酵母菌的生长有一定的抑制作用。

2.2 乳酸菌对腐败菌在液体条件下生长的抑制效果与分析

表1 牛津杯法测定乳酸菌对腐败菌的抑制效果Table 1 The inhibition of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms by Oxford cup method

泡菜生花主要是腐败微生物生长代谢产生的结果，泡菜一旦生花后，常表现出表面成膜、汁液浑浊、沉淀等现象。利用三株抑菌作用较强的乳酸菌用于测定在液体生长状态下对腐败菌的抑制作用，从表2结果来看，乳酸菌上清液的加入对供试腐败菌的产膜有较大程度的改善。乳酸菌SCP53对菌株1P-2和3P-1的产膜、沉淀、浑浊等现象都能有效抑制。对于菌株1P-1和4P-2，乳酸菌对其产膜有一定的抑制，其中乳酸菌SCP53的抑制效果最佳，4P-2无膜出现，但是1P-1还是有轻微的膜存在。因此，在液体条件下，腐败芽孢杆菌受到乳酸菌代谢产物的影响，生长代谢被抑制，腐败现象明显改善。然而腐败的酵母菌因不能完全被抑制，所以还是会呈现出不同程度的产膜、沉淀以及浑浊的现象。

为了考察乳酸菌对腐败菌生长量的抑制，测定了乳酸菌对腐败菌的抑制率（表3）。从表3可以看出，SCP21上清液对3P-1抑制效果明显，能抑制95.86%的菌株生长；SCP27能明显抑制菌株1P-2和3P-1的生长，抑制率达到99.85%和93.97%；SCP53对1P-2和3P-1的抑制率分别达到98.91%和99.45%。从百分比可得，三株乳酸菌对芽孢杆菌的抑制率都大于90%。从对酵母菌的抑制效果可得，SCP21对菌株1P-1和4P-2的抑菌率都较低，与表2中的现象相吻合。SCP27对两株菌的抑菌率在50%左右，虽然腐败菌数目减少了一半，但是仍然存在较大数量的菌株，因此在表2中腐败菌在液体中仍会出现长膜、沉淀、浑浊等现象。乳酸菌SCP53对菌株1P-1和4P-2的抑菌率分别为88.24%和76.47%，是三株乳酸菌中抑制酵母菌效果最好的菌株，在表2中也只是在1P-1试管中出现轻微长膜的现象，但是由于仍有部分菌体残留，所以液体仍然具有一定的浑浊度。因此酵母菌的数量对泡菜样品是否产膜以及浑浊度具有较高的相关性，数量越高，生花的程度以及液体的浑浊度越严重。

2.3 乳酸菌在泡菜发酵过程中的抑菌效果测定结果与分析

为了进一步验证SCP53对腐败菌在泡菜发酵过程中的抑菌效果，将其与腐败菌共同接种用于萝卜泡菜的发酵。从图1中可以直观的看出，第一排只接种腐败菌的样品均出现不同程度的长膜、汁液浑浊、颜色劣变现象。从成膜的现象来看，接种1P-1菌株的泡菜样品表现出了严重的生花情况，发酵液表面出现一层厚厚的皱褶膜，泡菜汁液变浑浊，其次为4P-2表面一层明显的白膜，泡萝卜颜色变白，汁液也较浑浊。3P-1有零星的明显的膜，泡菜颜色褐变。1P-2接种的样品颜色正常，但是也出现零星的生花现象。而下排与乳酸菌SCP53共同接种以后，泡菜品质均得到改善。生花最严重的1P-1产膜的现象得到明显控制，只出现零星的膜，颜色也得到较大改善；接种4P-2的样品生花现象得到控制，汤汁较清亮；接种3P-1的样品虽然仍存在褐变的现象，但是无生花和汤汁浑浊的情况。而对于接种1P-2的样品，不良现象几乎都被全部抑制，泡菜颜色非常鲜亮，汤汁澄清透明。结果表明：乳酸菌SCP53接种于发酵泡菜中能较好地抑制泡菜中生花腐败菌的生长，可单独或配合其他乳酸菌用于直投式泡菜菌种的制作。

图1 在泡萝卜中乳酸菌SCP53对腐败菌的抑制效果Fig.1 The inhibition of SCP53 to spoilage microorganism in radish pickle

表2 乳酸菌对腐败菌在液体条件下生长的抑制效果Table 2 The inhibiton of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms in liquid

表3 添加不同乳酸菌上清液对腐败菌的抑制率测定结果Table 3 Inhibition rate of LAB supernatant fluid to spoilage microorganisms

3 讨论

由于生产泡菜的蔬菜原料通常不会通过灭菌处理，因此泡菜经发酵后残留的腐败微生物在合适的条件下就容易出现生花、颜色退变、变软等腐败变质的现象[8]。筛选具有针对性抑菌能力的乳酸菌用于泡菜菌种的制作对发酵型泡菜的品质保证具有较好的作用。

笔者在论文的实施过程中并没有采用直接将乳酸菌和腐败菌接种到泡菜中的方式来观察实验结果，主要目的是为了排除原料中带有的微生物对实验结果的影响。通过平板和试管中的结果来进行筛选，结果更加准确。

供试的乳酸菌中有5株均为植物乳杆菌，菌株在产酸能力上并不存在太大的差异，而只有SCP53表现出了明显的抑制酵母菌生长代谢的能力，说明该菌株的代谢产物中可能含有细菌素类物质，在后续实验中我们将对其进行验证。

对接种乳酸菌和腐败微生物发酵的泡菜样品进行结果观察时，主要针对生花、颜色以及汤汁的浑浊程度来进行了验证。本应该对泡菜样品进行品尝，分析其对滋气味的变化，但是由于接种了一定量的腐败菌，出于安全的考虑未进行分析。后续我们还将通过质构仪、气相色谱、电子鼻等设备对接种腐败菌以及接种SCP53后对泡菜的质构及滋气味的变化进行进一步的分析和讨论。

4 结论

通过对比不同乳酸菌上清液对四株腐败菌在平板以及发酵液中的抑菌效果，筛选出对供试腐败菌都具有较强抑制作用的乳酸菌SCP53用于与腐败菌共同接种发酵萝卜泡菜。通过与只接种腐败菌的样品相比，菌株SCP53能有效抑制腐败菌产膜、变色、使汁液浑浊等现象，可用于直投式泡菜菌种的开发。

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Screening Lactobacillus to inhibit spoilage microorganism isolated from film-forming pickle

AO Xiao-lin1，PU Biao1，CAI Yi-min2，CHEN Cen1，HU Ai-hua1，CHEN An-jun1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625000，China；2.Japan International Research Center for Agricultural Sciences（JIRCAS），Ibaraki 305-8686，Japan）

Seven lactic acid bacteria strains isolated from high-quality pickle samples were screened to inhibit four kinds of spoilage microorganisms，which caused the pickle film.Lactobacillus plantarum SCP53，which had strong antimicrobial activity to tested spoilage microorganisms，was selected by oxford cup method and liquid culture（film，precipitation，liquid turbidity，and inhibition rate to spoilage microorganisms）.SCP53 and spoilage microorganisms were inoculated to make radish pickle，and the results indicated that SCP53 could prevent the formation of film and improved the quality of pickle.

pickle；lactic acid bacteria；spoilage microorganism；antimicrobial activity；screening

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0234-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.043

2014－03－25

敖晓琳（1979-），女，博士，讲师，研究方向：食品微生物与生物技术。

国家自然科学基金项目（31171726）；四川省科技支撑计划项目（2012NZ0002）。