壳聚糖双胍盐酸盐抑菌活性及其涂膜保鲜圣女果的研究

陈佳阳，罗永祥，陆旺金，傅夏兵，乐学义，*

（1.华南农业大学理学院应用化学系，广东广州510642；2.华南农业大学园艺学院，广东广州510642）

壳聚糖双胍盐酸盐抑菌活性及其涂膜保鲜圣女果的研究

陈佳阳1，罗永祥1，陆旺金2，傅夏兵1，乐学义1，*

（1.华南农业大学理学院应用化学系，广东广州510642；2.华南农业大学园艺学院，广东广州510642）

测定了壳聚糖双胍盐酸盐（CGH）对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和番茄丝核菌的抑菌能力；并通过涂膜的方法处理圣女果，测定贮藏过程中果实失重率、硬度、可溶性固形物含量（TSS）、维生素C（VC）含量、细胞膜透性和总酸含量的变化。结果表明，相对于壳聚糖（CTS），CGH对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有较强的抑菌能力，其最小抑菌浓度（MIC）分别为0.31mg/mL和0.62mg/mL；当CGH浓度达到2.00mg/mL时对番茄丝核菌菌丝生长抑制率可达到100%。以质量浓度为3%的CGH涂膜处理的圣女果在（28±2）℃存放12d后，失重率仅为7.5%，硬度仍有21.121N/cm2，TSS为7.2%，VC含量为21.70mg/100g FW（鲜重），膜渗透率为27.4%，可滴定酸含量为0.35%。与对照（CK）相比，显著保持了果实的品质。

壳聚糖双胍盐酸盐，圣女果，抑菌，保鲜

利用涂膜的技术对果蔬进行保鲜，成本低，易于操作，已受到国内外学者的关注[1-4]。壳聚糖（CTS）属于天然高分子化合物，无毒、可生物降解，理化性能相对稳定，具有成纤成膜性[5]和抗菌性[6]，目前已经有大量文献报道其对果蔬具有显著的抗菌保鲜作用[7-10]。但是，由于壳聚糖整个大分子链上有较高密度的分子内和分子间氢键使之不溶于水也不溶于碱溶液，只溶于小部分有机酸溶液，导致它在应用上受到极大限制[11]。将具有抑菌作用的小分子基团接枝到壳聚糖上，既能改善壳聚糖的水溶性又能增强其抗菌性和防止小分子抑菌剂对人体的毒害作用[12]。本文将具有广谱抗菌作用的双胍基[13]接枝到壳聚糖结构单元上后制得具有一定保鲜抗菌能力的高分子化合物壳聚糖双胍盐酸盐（CGH）。该壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及常见的致使水果腐烂的真菌均具有较好的抑制作用。将CTS应用于圣女果的研究已有报道[14-15]，但将CGH应用于圣女果的保鲜工作目前尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

圣女果 市售，选择果实新鲜，表面光滑，大小、成熟度基本一致，无机械损伤和病虫害的圣女果进行实验；金黄色葡萄球菌（S.Aureus）、大肠杆菌（E. Coli）和番茄丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn） 均由华南农业大学资源环境学院提供；壳聚糖（脱乙酰度≥85%） 山东奥康生物科技有限公司；2，6-二氯酚靛酚钠盐 为生物纯；草酸 优级纯；无水乙醇、氢氧化钠、冰乙酸、标准抗坏血酸（VC） 均为分析纯；高岭土 化学纯；壳聚糖双胍盐酸盐 为自制，经元素分析测定其接枝率为50.5%。

DDS-12A型电导率仪 上海精密科学仪器有限公司；果蔬材料硬度测试机 美国Instron公司；PR-α型数显折光仪 日本ATAGO公司；SW-CI-IF型洁净工作台 上海博迅实业有限公司；LRH-250-S（Ⅱ）型微电脑控制恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂。

1.2 CGH的体外抗菌实验

1.2.1 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用 采用二倍稀释法[16]测定CTS和CGH对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.2 对番茄丝核菌菌丝体径向生长的影响 将CTS和CGH分别配制成不同浓度的溶液，用1mol/L NaOH调节溶液pH=5～6。配制含药品浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00mg/mL的PDA培养基，在已经培养成熟的菌落（真菌PDA培养基）边缘打取直径5mm供试菌饼移入到含药培养基中心，28℃恒温培养，待对照组（CK，0mg/mL）菌落长满平板时，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率[17]。

式中，D空白为对照菌落直径，D药品为处理菌落直径。

1.3 圣女果的涂膜处理

制取0.5%（V/V）壳聚糖乙酸溶液，并用1mol/L NaOH溶液调至pH=5～6；用去离子水溶解不同质量的CGH制成质量分数分别为1%、2%和3%的膜溶液[18]，同时调节pH=5～6。挑选新鲜、且果皮颜色和大小均匀，无明显病虫害的圣女果为样品，随机分成5组（每组100个果实），其中一组将作为对照。将上述5组分别浸入制好的壳聚糖乙酸溶液中，静置3min，沥干，分别放入大小相同的篮中，室温（28±2）℃下存放。

1.4 测试指标及方法

圣女果于购买当日分别进行重量、可滴定酸（TA）含量、可溶性固形物（TSS）含量、VC含量、果实硬度、果皮细胞膜渗透率指标的测定，贮藏期间每2d测定1次，每次每组随机抽取果实10个，重复3次。

1.4.1 失重率测定 采用称重法，分别测定待贮存的圣女果质量（m0）与贮存一定时间后的质量（mt）。

1.4.2 可滴定酸（TA）含量的测定 参照文献[19]的方法，取10g果肉，用研钵磨碎，加以煮沸、冷却、去除CO2的蒸馏水25mL，在沸水浴中提取30min，冷却，过滤，移入50mL容量瓶中，定容至50mL，每次取10mL，加酚酞指示剂2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至微红色在1min内不褪色为终点。

式中：N：NaOH标液的摩尔浓度，mol/L；V：消耗NaOH标液的体积，mL；W：样品用量；K：换量为适当酸的系数（以苹果酸为标准；K=0.067）。

1.4.3 可溶性固形物（TSS）含量测定 采用PR-32α数显折光仪进行测定。

1.4.4 VC含量测定 参考2，6-二氯酚靛酚法[20]准确称取10g左右的圣女果，加入30mL 2%草酸，打成浆状，离心，准确吸取上清液5mL，用标定好的2，6-二氯酚靛酚钠盐滴定。另取5mL 2%草酸作空白对照滴定。

式中，w：100g样品（鲜重，FW）含VC毫克数，VA：滴定样品所耗用的染料平均体积，mL；VB：滴定空白对照所耗用的染料的平均体积，mL；VT：样品提取液的总体积，mL；VS：滴定时所取样品提取液体积，mL；A：1mL染料能氧化抗坏血酸量，mg/mL；W：待测样品的质量，g。

1.4.5 硬度的测定 用果蔬材料硬度测试机测定圣女果的硬度。所选择探头为圆锥形，基部直径为4mm，硬度值用N/cm2表示。

1.4.6 细胞膜透性测定 根据文献[21]将圣女果果肉切成5mm×5mm块状，混匀后称取5.0g于50mL烧杯中，加40mL蒸馏水，用电导率仪测出电导率（P0），浸泡10min后测出电导率（P1），再将烧杯放置于水浴锅中，加热煮沸10min后补足失去的水分，冷却后测定电导率（P2）。

1.5 统计方法

每处理3个重复，数据用SPSS软件进行统计，用最低显著性差异法（LSD）在0.05水平上进行显著性差异检验。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌实验结果

2.1.1 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用 通过二倍稀释法测得CGH对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别为0.31mg/mL和0.62mg/mL，而CTS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别的0.62mg/mL和1.25mg/mL，由此可得出CGH抑制这两种细菌的活性强于CTS，并且CGH对G+的抗菌性要强于G-。这可能同菌细胞壁组成相关，大肠杆菌比金黄色葡萄球菌多了一层外层膜（outer membrane），外层膜中除了含有脂多糖、核糖和O抗原外，还有孔蛋白，而这种孔蛋白只允许特定的分子通过，所以CGH对其抑制活性较弱[22]。

2.1.2 对番茄丝核菌的抑制作用 CTS及CGH对番茄丝核菌的抑制作用如图1所示。

图1表明，CTS与CGH对番茄丝核菌丝生长都具有抑制活性。当浓度为2.00mg/mL时，CGH对番茄丝核菌的抑制率为100%，而CTS为80.4%，说明CGH的抑菌作用明显强于CTS。这可能源于CGH胍基易质子化而导致其正电性大于CTS，更有利于吸附在菌体细胞上，扰乱细胞的正常生理活动而抑制病菌的生长。

图1CTS及CGH对番茄丝核菌的抑菌率Fig.1 The fungistasis activities of various concentrations of CTS and CGH against Rhizoctonia solani Kuhn

2.2 失重率的变化

测定了不同涂膜的圣女果在贮藏过程中果实失重率的变化，结果如图2所示。

图2CTS和CGH涂膜对圣女果室温贮藏期间失重率变化的影响Fig.2 Effect of CTS and CGH coatings on mass loss of cherry tomatoes during room temperature storage

结果表明，平行3次测定失重率偏差很小，导致图2中偏差线不明显。由图2可见，随着圣女果存放时间延长，各组失重率不断上升，经过12d室温存放后，经过3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜处理的圣女果的失重率分别为7.8%、8.9%、8.1%和7.5%，而对照样为10.4%。在同样为3%的浓度下，用CGH处理过的圣女果失重率低于CTS，表明3%CGH对圣女果的保鲜作用优于3%CTS。另外，1%CGH和2%CGH涂膜效果不如3%CTS好，原因可能是由于膜厚度不够，导致果实中水分蒸发相对较快。

2.3 TA含量的变化

测得不同涂膜圣女果在相同存放条件下TA含量的变化如图3所示。

结果表明，在贮藏过程中，由于存放条件为室温，温度和湿度变化较大，导致圣女果中TA含量出现波动，但其总体趋势是波动下降的。另外，从贮藏后期的结果发现，经过12d后，由3%CTS、3%CGH涂膜处理的圣女果的可滴定酸含量分别为0.32%、0.35%，而对照组可滴定酸含量为0.16%。其中，12d后3% CGH涂膜的圣女果可滴定酸含量是对照组的2倍，这可能源于CGH涂膜处理后减少了圣女果中水分的蒸发，抑制了水果的呼吸，从而延缓了果实新陈代谢的速度。由此可得几组涂膜处理中，3%CGH对圣女果酸含量的保持效果最好。

图3 圣女果贮藏过程中TA含量的变化图Fig.3 Effect of CTS and CGH coatings on TA content of cherry tomatoes during room temperature storage

2.4 TSS含量的变化

测得不同涂膜的圣女果在贮藏过程中可溶性固形物含量的变化如图4所示。

图4 圣女果贮藏过程中TSS含量的变化Fig.4 Effect of CTS and CGH coatings on TSS content of cherry tomatoes during room temperature storage

可溶性固形物含量是指该果实中包含的能溶于水的糖、酸、矿物质等占果实总质量的百分率[23]。可溶性固形物的积累与果实在贮藏过程中细胞壁结构的变化和多糖降解为低分子糖相关[24]。当果实成熟后，可溶性固形物含量将呈上升趋势[25]。结果表明，贮藏6d后，对照组的可溶性固形物含量上升速度增快，12d后达到9.2%，而经3%CGH涂膜的增长速度较缓，12d后可溶性固形物含量为7.2%，并且低于3% CTS涂膜的7.5%。

2.5 VC含量的变化

圣女果中含有丰富的VC，是普通番茄的1.7倍。众所周知，VC是衡量水果营养价值的重要指标，通常因贮存时间的延长使果实中的VC氧化分解而快速下降，所以常以VC的含量损失来评价水果的品质。测得不同涂膜条件下圣女果在贮藏过程中VC含量的变化如图5所示。

图5表明，所有圣女果在贮藏期间VC含量均有所下降，但涂膜组圣女果VC含量降低的速度均小于对照，说明涂膜具有一定的保鲜效果。其原因可能是在果皮中形成的膜阻止了空气中部分氧的进入而减少VC的氧化。并且研究发现，常温下贮存12d后，测得经3%CTS处理的圣女果VC含量为21.03mg/100g FW，而3%CGH处理的圣女果VC含量达到21.70mg/100g FW，表明CGH保鲜作用优于CTS。

图5 圣女果贮藏过程中VC含量的变化图Fig.5 Effect of CTS and CGH coatings on VCcontent of cherry tomatoes during room temperature storage

2.6 硬度变化

果实的硬度是指果肉抗压力强弱的程度，果肉抗压力愈强，果实的硬度就愈大。果实硬度的大小可以反映贮藏过程中及贮藏结束时果实品质的优劣。测得不同涂膜处理的圣女果在贮藏过程中硬度的变化如图6所示。

图6 圣女果贮藏过程中硬度的变化图Fig.6 Effect of CTS and CGH coatings on firmness of cherry tomatoes during room temperature storage

圣女果采收后，使其软化的生理生化因素很多，但主要是通过果实内果胶物质含量变化引起的。果实中脂氧合酶（LOX）、果胶酶等酶的活性随果实成熟度的增加而迅速增加，使果实硬度下降[26]。结果表明，在贮藏的中前期，圣女果保持鲜脆状态，硬度变化不大，而在贮藏后期，果实由于失水硬度迅速下降。并且发现，在常温条件下存放12d后，空白样的圣女果硬度为19.139N/cm2，而经过3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜处理的圣女果的硬度分别为21.082、20.101、20.827、21.121N/cm2，表明CTS和CGH对圣女果均有保鲜作用，但是在同是3%的浓度下，CGH对圣女果硬度的保持效果优于CTS。

2.7 细胞膜渗透性的变化

随着果实采后存放时间的延长，果实中细胞膜渗透性逐渐改变甚至丧失，引起细胞内物质大量外渗[27]，因而细胞膜渗透性可作为果实衰老的重要指标。测得不同涂膜的圣女果在贮藏过程中细胞渗透率的变化结果如图7所示。

图7 圣女果贮藏过程中细胞膜渗透率的变化图Fig.7 Effect of CTS and CGH coatings on ion leakage of cherry tomatoes during room temperature storage

图7表明，随着存放期增长，各实验组圣女果的细胞膜渗透性均逐步增加。存放12d后，测得3%CGH和3%CTS涂膜的圣女果细胞膜渗透率分别为27.4%和31.3%，均明显低于对照组的42.4%，表明CGH和CTS涂膜都具有保鲜作用。并且发现，从第4d开始，同样是3%浓度的涂膜，用CGH涂膜处理的圣女果细胞膜渗透率就明显低于CTS的涂膜处理。由些可见，圣女果在常温贮藏过程中，3%CGH涂膜处理比3%CTS更有助于保持圣女果细胞组织的完整性。

3 结论

体外抗菌实验表明，CGH对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和番茄丝核菌的生长抑制作用均强于CTS，当CGH浓度为2.00mg/mL时，可完全抑制番茄丝核菌的生长。与CTS相比，CGH溶液涂膜处理圣女果可显著减缓果实质量的损失，保持TA、TSS和VC的含量以及果实的硬度，减缓细胞膜渗透率的增长，有效地延缓了果实的衰老过程，起到了保鲜保质的作用。然而，为了进一步提高该类壳聚糖衍生物膜的保鲜作用，其抗菌作用机理有待于进一步研究，需要进一步改善膜力学性能等。

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Effects of chitosan biguandine hydrochloride coating on storage quality of cherry tomato and its antimicrobial activities

CHEN Jia-yang1，LUO Yong-xiang1，LU Wang-jin2，FU Xia-bing1，LE Xue-yi1，*
（1.Department of Applied Chemistry，College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The antimicrobial activities of Chitosan biguandine hydrochloride（CGH）against S.Aureus，E.Coli and Rhizoctonia solani Kuhn were studied，respectively.Cherry tomatoes mass-loss ratio，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content was examined attentively after fresh-keeping process with CGH as coating film.The minimal inhibited concentrations（MIC）against S.Aureus and E.Coli were 0.31 and 0.62mg/mL，respectively.CGH at 2.00mg/mL had a total antifungal effect on Rhizoctonia solani Kuhn.CGH with concentration of 3%coated on the cherry tomatoes showed a better preservation effect after 12d storage under（28±2）℃.The mass-loss，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content were 7.5%，21.121N/cm2，7.2%，21.70mg/100g FW（fresh weight），27.4%and 0.35%，respectively.

chitosan biguandine hydrochloride；cherry tomatoes；antibacterial activity；fresh-keeping

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0306-05

2013－06－21 *通讯联系人

陈佳阳（1986-），女，硕士研究生，研究方向：生物材料及水果保鲜。

广东省科技计划项目（2011B020310005）；华南农业大学211工程基金项目（2009B010100001）。