江苏徐州市鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

（徐州生物工程职业技术学院/徐州市现代农业生物技术重点实验室，江苏徐州 221006）

江苏徐州市鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

李华坤，孙 朋

（徐州生物工程职业技术学院/徐州市现代农业生物技术重点实验室，江苏徐州 221006）

[目的]调查徐州地区鸡白痢沙门氏菌的耐药性。[方法]从徐州不同地区分离鉴定了19株鸡白痢沙门氏菌，并对19株鸡白痢沙门氏菌分离株进行了药敏试验。[结果]该地区鸡白痢沙门氏菌的多重耐药率为94.7%，多重耐药谱为PG-MY-DOX-TET-AMP的菌株百分比为42.1%，对青霉素和林可霉素耐药率为100%，而对氨苄西林、四环素和新霉素耐药率在50%以上，对头孢唑啉和强力霉素耐药率为40%～50%，对头孢氨苄和复方新诺明耐药率为20%～30%，对氟苯尼考、阿米卡星和环丙沙星未出现耐药菌株，对氟苯尼考和头孢曲松高敏菌株在80%以上。[结论]徐州地区鸡白痢沙门氏菌的多重耐药情况比较严重。

鸡白痢沙门氏菌；分离鉴定；耐药性；耐药率；药敏试验；多重耐药率；多重耐药谱

今年鸡白痢病在徐州地区明显呈现上升趋势，对当地养鸡业造成了很大损失，为指导该病的防控，我们从徐州各地区采集了疑似鸡白痢沙门氏菌病料，并进行了分离鉴定，对其耐药性进行了分析，旨在给当地防控工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

血清琼脂培养基、麦康凯培养基均购自广东环凯公司。DMBA210型数码显微镜（麦克奥迪）、WJ-80-III型CO2培养箱（南京庚辰）、TGL-16G型高速冷冻离心机（上海安亭）、CHB-100型恒温金属水浴锅（杭州大和）、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安）、生化反应管（杭州天和）、超净工作台、振荡器、各种微量移液器等。

1.2 细菌分离

在徐州各县区养鸡场或农户采集肝脏和心脏等脏器有疑似沙门氏菌感染的禽类病料。无菌采取典型病死鸡的肝脏和胆囊组织，参照文献[1]三区划线接种于麦康凯培养基，37℃培养18～24 h，挑取

白色透明的可疑菌落传代，经革兰氏染色后，镜检。

1.3 生化试验

从分离出的菌株纯培养物中挑取单个典型菌落，按照常规方法进行生化试验，置于37 ℃恒温箱培养18-24 h，观察结果。

1.4 16s rRNA基因测序

将分离细菌采用煮沸裂解法制备细菌模板，按照16s rDNA Bacterial Identifcation PCR Kit（宝生物工程（大连）有限公司）方法操作，PCR扩增出产物，经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，将目的片段送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 药敏试验

选用18种徐州地区常用的抗菌药物，采用Kirby-Bauer 法，参照（CLSI/NCCLS）2012版执行标准判定结果。抗菌药物有：氟苯尼考（forfenicol，FFC）、诺氟沙星（norfoxacin，NOR）、庆大霉素（gentamycin，GEN）、头孢唑啉（cefazolin，CEF）、阿米卡星（amikacin，AMK）、强力霉素（doxycycline，DOX）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、头孢噻肟（cefotaxime，CTX）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、青霉素（penicillin G，PG）、新霉素（neomycin，NEO）、复方新诺明（selectrin，SXT）、四环素（tetracycline，TET）、头孢曲松（ceftriaxone，CRO）、林可霉素（Lincomycin，MY）、环丙沙星（ciprofoxacin，CIP）、头孢氨苄（cefalexin，CLX）。

2 结果

2.1 细菌分离

分离菌在血清琼脂培养基上中等大小、边缘整齐、表面光滑湿润、乳白色的圆形菌落；在麦康凯培养基上能长出形态相似的无色透明菌落。镜检结果显示该细菌为G-、散在、小球杆菌。将分离得到的19株疑似沙门氏菌分别命名为S1-S19。

2.2 生化试验

分离的细菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇，产酸产气，甲基红试验阳性，不能发酵乳糖和蔗糖，不产生α-甲基葡萄糖苷，不产生吲哚，不分解尿素，VP试验阴性，符合沙门氏菌的生化特征。

2.3 16s rRNA测序结果

用试剂盒扩增分离菌的16s rRNA片段，经琼脂糖凝胶电泳后，得到500 bp的目的片段，最后将测定的序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对。参考株鸡白痢沙门氏菌菌株来自于GenBank序列号为GU183553.1。分离菌16s rRNA 序列同源性达97%以上（图1）。

图1 19株沙门分离菌的16S rRNA序列同源性

2.4 药敏试验

2.4.1 耐药分布。从表1可以看出，徐州地区鸡白痢沙门氏菌对PG、MY耐药率为100%，而对AMP、TET、NEO 3种药物耐药率在50%以上，对CEF、DOX耐药率为40%～50%，对CLX、SXT耐药率为20%～30%，对NOR、GEN、CTX、KAN、ENR、CRO耐药率为10%～20%，对FFC、AMK和CIP未出现耐药菌株，但出现不同程度的

中度敏感菌株，对FFC和CRO高敏菌株占80%以上。

表1 19株鸡白痢沙门氏菌对18种常用抗菌药物的耐药率

2.4.2 多重耐药。从表2可以看出，19株鸡白痢沙门氏菌分离株中除S3之外，其余18株对三类或三类以上抗菌素同时耐药，多重耐药百分率为94.7%，其中多重耐药谱为PG-MY-DOX-TET-AMP的菌株占42.1%，16株对5种以上抗生素耐药，其中5耐菌株占26.3%，6耐菌株占36.8%，7耐、8耐、10耐及12耐菌株各占5.3%。

表2 19株鸡白痢沙门氏菌的多重耐药谱

3 讨论

本研究中采集的病料为新鲜病料，及时进行了细菌的分离，没有进行冷冻保存，避免了冷冻对分离率的影响，我们共分离鉴定了19株鸡白痢沙门氏菌。药敏试验结果显示，分离鉴定的鸡白痢沙门氏菌对PG耐药率达100%，对AMP耐药率达73.7%，对TET、NEO和DOX均呈现较高的耐药率，此结果与代娟娟[2]、王娟等[3]研究结果基本相符。本研究中鸡白痢沙门氏菌对CLX、CEF、CTX和CRO的耐药率分别为26.3%、42.1%、10.5%和10.5%，与程春荣[1]、代娟娟[2]、蒋清蓉等[4]报道的鸡白痢沙门氏菌对头孢类抗生素的耐药程度性一定的差异。

本研究中，徐州地区沙门氏菌的多重耐药率高达94.7%，表明徐州地区鸡白痢沙门氏菌的耐药性比较严重。与郑州[1]、合肥[5]地区沙门氏菌的多重耐药谱相比，三者相似处皆为PG-AMP，其结果表明，随着青霉素和氨苄西林在兽医临床的广泛使用，青霉素类抗菌药物在各地区的耐药性均比较严重。而徐州地区鸡白痢沙门氏菌对PG、MY、AMP、TET、NEO等药物均已经产生了耐药性，而对FFC、AMK、CIP、CRO等药物依然敏感。

潘志明等[6]研究表明鸡白痢沙门氏菌的耐药性与兽医临诊上使用的抗菌药物有关，根据我们问诊的结果也显示，菌株的耐药谱确实与畜主不合理的使用药物有关。为防止耐药菌株的出现，饲料中不要随意添加抗菌类药物，预防用药时，要经常调换药物的种类，或者使用中草药防治，在治疗时应通过药敏试验，选出敏感药物，合理使用抗生素，建议在兽医临床上建立健全沙门氏菌耐药监测机制。

[1]程春荣，安戈，罗琦，等.145株沙门氏菌耐药性分析[J].河南预防医学杂志，2012，23（4）：256-261.

[2]代娟娟，孙金华，常维山.鸡白痢沙门氏菌耐药性分析[J].山东畜牧兽医，2008，29（11）：56-57.

[3]王娟，曲志娜，赵思俊，等.禽源大肠杆菌和沙门氏菌耐药性研究[J].中国动物检疫，2009，26（5）：64-65.

[4]蒋清蓉，张德胜，赖守勋，等.四川地区蛋鸡孵化场沙门氏菌调查[J].四川畜牧兽医，2012，39（4）：20-21.

[5]王元兰，刘军军，邵颖，等.源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性与血清型、基因型相关性分析[J].安徽农业大学学报，2013，40（4）：540-546.

[6]潘志明，焦新安，刘文博，等.鸡白痢沙门氏菌耐药性的监测研究[J].畜牧兽医学报，2002，33（4）：377-383.

Identifcation and Analysis of Drug Resistance of Salmonella Pullorum in Xuzhou Area

Li Huakun Sun Peng

（Xuzhou Key Laboratory of Modern Agro-Biotechnology，Xuzhou Vocational College of Bioengineering，Xuzhou 221006）

In order to investigate drug resistance of Salmonella pullorum in Xuzhou，19 strains of Salmonella pullorum were studied for drug sensitivity test in this report. The results showed that the percentage of multiple drug resistance was 94.7%，the multiple-antimicrobial-resist bacteria spectrum of PG-MY-DOX-TET-AMP accounted for 42.1%，the rates of drug resistance of the penicillin G and Lincomycin were 100%，the rates of drug resistance of the ampicillin，tetracycline and neomycin were more than 50%，the rates of drug resistance of the cefazolin and doxycycline were between 40%-50%，the rates of drug resistance of the cefalexin and selectrin were between 20%-30%，no bacterial isolates of resistant to forfenicol，amikacin and ciprofoxacin，the highly sensitive bacterial isolates of the forfenicol and ceftriaxone were more than 80%. Therefore，drug resistance of Salmonella pullorum was very serious in the Xuzhou area.

Salmonella Pullorum；identification and analysis；drug resistance；the rate of drug resistance；drug sensitivity test；multiple drug resistance；the multiple-antimicrobial-resist bacteria spectrum

S855.1

：A

：1005-944X（2014）12-0047-03

徐州市科技计划项目（XF12C039）