生物合成Cr2O3纳米颗粒

董国文，吴钟海，张丽华，王仁章

（三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004）

生物合成Cr2O3纳米颗粒

董国文，吴钟海，张丽华，王仁章

（三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004）

微生物还原固定铬对Cr(VI)污染环境修复具有重要意义。筛选获得一株Cr(VI)还原菌株XMCr-6，并对其生物还原固定Cr(VI)进行了研究。动力学实验显示Cr(VI)是先还原，然后吸附固定在细胞表面。XPS分析表明铬在细胞表面主要是以三价的形式存在，高分辨透射电镜结合能谱分析进一步证实是形成Cr2O3纳米颗粒。

Cr(VI)；生物修复；纳米Cr2O3；废水处理

在工业化进程加快的今天，环境问题日益凸显，特别是重金属铬污染问题越发严重。2012年“毒胶囊事件”使得铬污染及其对人体的危害再度成为公众关注的焦点。铬污染主要是指由Cr (VI)所引起的污染。具有毒性的Cr(VI)污染物不仅对环境、牲畜有毒害作用，对人体也有“三致”作用[1]，其毒性约是Cr(III)的100倍[2]。把Cr(VI)还原成Cr(III)，不仅是一种有效的解毒方式，而且也是从水环境中去除铬的关键步骤。已有研究发现环境中部分微生物能够在有氧或厌氧的条件下将 Cr(VI)还原成 Cr(III)[3-4]，说明微生物在修复Cr(VI)污染的水体具有巨大的潜力。传统的物理化学方法如还原沉淀、离子交换和反渗透用来处理Cr(VI)的污染使其达标排放，意味着高运行成本，寻求一种高效便捷的铬污染治理方法显得尤为重要。

1 实验材料与方法

1.1 材料和试剂

菌株XMCr-6(本实验室保存)，重铬酸钾(AR，国药集团化学试剂有限公司)，二苯基碳酰二肼(AR，国药集团化学试剂有限公司)，丙酮(AR，国药集团化学试剂有限公司)，酵母粉(BR，OXOID)，胰蛋白胨(BR，国药集团化学上海化学试剂公司)。LB培养基：10 g·L-1胰蛋白胨，5.0 g·L-1酵母提取物和 5.0 g·L-1氯化钠。

1.2 微生物还原Cr(VI)

菌株XMCr-6过夜培养，然后在4°C低温条件下离心获得完整细胞，完整细胞用无菌磷酸盐缓冲液(PBS,0.2 mol·L-1，pH=7.0)清洗3次，并重新悬浮，最终浓度为0.1 g·mL-1(湿重)。加入Cr(VI)并使终浓度为100 mg·L-1。还原反应在离心管中进行，28°C条件下连续震荡12 h(150 r·min-1)。细胞用PBS清洗3次，冷冻并低温(-50°C)干燥(EYELA FD-1000,Japan)。

1.3 胞外Cr2O3纳米颗粒的表征

冷冻干燥样品用于光电子能谱XPS分析(PHI,QUANTUM 2000,USA)。用于透射电镜(TEM)的样品用PBS清洗后用2.5%戊二醛在4°C固定2 h后，用移液器吸取5 μL溶液点滴到铜网的碳膜上，放置2 h用于TEM-EDX(Tecnai F30)表征。

1.4 测试方法

总铬采用AAS测试 (TAS-986，北京普析通用)，Cr(VI)采用1,5二苯卡巴肼分光光度法测试(TU1900，北京普析)。

2 结果与讨论

2.1 不同生长条件对菌株XMCr-6还原Cr(VI)的影响

经过对菌株XMCr-6进行驯化，能够在48 h内还原100 mg·L-1的Cr(VI)，同时考察了不同温度、pH和Cr(VI)初始浓度对其还原Cr(VI)的效果，结果见图1～3。

图1温度对菌株XMCr-6还原Cr(VI)的影响

图2 pH对菌株XMCr-6还原Cr(VI)的影响

分别考察了菌株XMCr-6在温度为22，28，37°C条件下对Cr(VI)的还原情况，发现菌株XMCr-6 在3种温度条件下分别能还原46%，91%和97%的Cr(VI)(100 mg·L-1)。还原能力在温度为28和37之间差距较小，温度在22°C时还原能力有明显抑制。菌株XMCr-6在很广泛的pH(5～9)范围内能还原Cr(VI)，最大的还原率出现在pH=8～9，但pH=5时，Cr(VI)的还原几乎停止。还考察了不同Cr(VI)浓度对菌株XMCr-6还原能力的影响，发现菌株XMCr-6在36和48 h内能分别完全还原50和100 mg·L-1Cr(VI)。在Cr(VI)浓度为150和200 mg·L-1时，菌株XMCr-6在84 h内分别能还原94%和70% 的Cr(VI)。

2.2 生物吸附还原机制

微生物还原Cr(VI)的机制有多种，还原过程也比较复杂，为了弄清楚菌株XMCr-6还原Cr(VI)的机制，做了菌体还原Cr(VI)的动力学实验。从图4中可知，Cr(VI)在pH=7的情况下没有吸附到细胞上。然而，当pH调到2时，立刻有大量(73%)的Cr(VI)被吸附到细胞上。先前生长条件实验中细胞均在pH=7的条件下还原Cr(VI)。并且已有报道酶促反应引起的Cr(VI)还原是在pH=7.0～7.5的条件下发生的，而非生物还原是在较低pH条件下(pH=2.0～3.0)[5]。这是由于Cr(VI)阴离子是带负电荷，在低pH条件下有利于吸附到细胞或者其他生物分子上。与此同时，动力学实验结果显示Cr(VI)的还原和Cr(III)的固定不是同步的(表1)，还原反应3 h时，有40.4%的Cr(VI)被还原，然而只有71.4%的Cr (III)被固定。从3 h到15 h，Cr(III)的固定从71.4%上升到95.6%，说明Cr(VI)的还原要快于Cr(III)的固定。由此说明是Cr(VI)先还原，然后还原的Cr(III)与细胞吸附并被固定在细胞表面。

图3 Cr(VI)浓度对菌株XMCr-6还原Cr(VI)的影响

图 4 pH值对Cr(VI)吸附的影响

表1 不同时间铬的还原率和固定率

2.3 细胞表面纳米Cr2O3颗粒表征

Cr(VI)还原后细胞上铬的可能化学价态通过XPS来分析(图5)，数据显示细胞表面的铬有两个明显的峰值：586.5 eV(Cr 2p1/2)和 577.8 eV(Cr 2p3/2)，而标准的Cr2O3的峰为：Cr 2p1/2 586.0 eV 和 Cr 2p3/2 576.2 eV[6]。与标准的Cr2O3的峰值比较，证实细胞表面的铬是Cr(III)。通过TEM观察细胞表面，发现在细胞表面及细胞与细胞之间存在大量粒径在4 nm的颗粒(图6a)，随后的EDX能谱显示这些沉积物包含铬(图6)。这些沉淀物主要是球形的和少量无定型的纳米颗粒。此外，高分辨透射电镜(HRTEM)已经有用来表征Cr(III)的纳米颗粒[7]，本实验中用HRTEM来表征纳米颗粒(图6b)，结果显示晶格间距是0.246 nm，这是Cr2O3的110面[8]。结合XPS的结果，可以证实形成的是Cr2O3纳米颗粒。

以前研究结果中很少有通过微生物还原形成球形的Cr2O3纳米颗粒。本研究中，Cr2O3纳米颗粒被菌株XMCr-6生物合成，主要是沉淀在细胞表面。Cheung报道了其他一些不同的观察结果，铬的聚集物存在于Bacillus megaterium TKW3的细胞膜内[9]，而Daulton应用TEM-EDX发现密集的聚合物沉淀在整个细胞表面[10]。

图5 细胞表面纳米颗粒XPS表征

图6 细胞外纳米颗粒的TEM-EDX和HRTEM表征

3 结论

自然界中许多菌种具有Cr(VI)还原能力，因而用微生物法治理铬污染已受到人们的广泛认可。然而，大部分报道都集中在Cr(VI)的还原过程而很少关注形成Cr(III)的最终产物[11-12]，其实Cr(III)的最终产物才决定铬的生物有效性。微生物还原Cr(VI)的最终产物一般包括可溶和不溶的Cr(III)[13]。如有些微生物能够将Cr(VI)还原为不溶的氢氧化物[9,14]、与有机配体形成可溶的有机-Cr(III)复合物[15]。Cr(III)的有机复合物或沉淀物对细胞的损伤是最小的[16]，这可能是微生物为了保护自己而进行的一种解毒机制。本实验对菌株XMCr-6还原解毒Cr(VI)的特性和机理进行了研究与探讨，发现菌株XMCr-6能够在很宽的温度(22～37℃)和pH(6～9)范围内生长，48h内能完全还原100 mg·L-1的Cr(VI)；菌株XMCr-6还原Cr(VI)的机制是先还原Cr(VI)，逐步吸附沉淀到细胞上，最终形成Cr2O3纳米颗粒。微生物将Cr(VI)转化为Cr(III)的沉淀物而去除，被认为是生物解毒的一种机制，也是Cr(VI)污染物去除的一种彻底解决含铬有毒物的环保新技术，其结论可为含铬废水、废渣生物处理提供理论依据。

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(责任编辑：朱联九）

Biosynthesis of Cr2O3Nanoparticles by Strain XMCr-6

DONG Guo-wen,WU Zhong-hai,ZHANG Li-hua,WANG Ren-zhang

(College of Resource and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

A basic understanding related to the immobilization of chromium by bacteria is essential for chromate pollutant remediation in the environment.In this work,the Cr(VI)-immobilization process by strain XMCr-6 was studied. The kinetics experiment result showed that Cr(VI)reduction and Cr(III)immobilization happened asynchronously,the binding sequence of Cr(III)on the cell surface was bound after reduction.X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)analysis revealed that the chromium accumulated on bacteria were mostly in Cr(III)states.Scanning electron microscopy (SEM)observations showed that noticeable Cr(Ill)precipitates were accumulated on bacterial surfaces.HRTEM image coupled with energy-dispersive X-ray spectroscopy showed that the Cr2O3nanoparticles were obtained during the Cr(VI) reduction process.

Cr(VI);Bioremediation;Cr2O3Nanoparticles;waste treatment.

X172

A

1673-4343（2014）04-0001-05

10．14098／j．cn35－1288／z．2014．04．001

2013-12-08

国家自然科学基金（41301346）；福建省科技厅重点项目（2012Y0061）；福建省大学生创新计划项目（ZL1125／CS）；2011洁净煤气化技术协同创新中心项目

董国文，男，安徽宿松人，博士，讲师。研究方向：污染环境生物修复。