库尔勒香梨采后贮藏期间“黑头病”致病菌生物学特性的研究

杨焱，陈国刚

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

库尔勒香梨采后贮藏期间“黑头病”致病菌生物学特性的研究

杨焱，陈国刚*

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

库尔勒香梨采后贮藏期间“黑头病”致病菌菌丝生长最适温度为28℃，最适pH值为7，在PDA培养基和梨汁培养基上有利于菌丝生长和产孢量。碳源、氮源对菌丝生长和产孢量的影响差异明显，葡萄糖和蛋白胨为致病菌的最佳碳源和氮源。分生孢子对光比较敏感，完全光照有利于致病菌菌丝生长和分生孢子的产生量。55℃水浴处理10 min可致死致病菌的分生孢子，紫外辐照时间越长分生孢子的致死率越高。

库尔勒香梨；生物学特性；分生孢子

新疆库尔勒香梨是我国的名优特林产品之一。近年来，库尔勒香梨出口国际市场，在国际市场占有的市场份额越来越大。现在对库尔勒香梨的采后贮藏保鲜中出现新难题，萼部坏死当地果农称为“黑头病”。“黑头病”是由多主枝孢菌（Cladosporium herbarumLink）引起[1]，黑头病表现为果实萼端深绿色，且硬度较高，发病初期萼端果皮变黑色，若切开表皮，果肉有浅褐色蜂窝状坏死现象，果肉略有苦味。发病后期黑头部位稍有塌陷，萼端产生黑色霉层，病斑边缘处果皮变为黑色，病斑与内部好果肉交界非常明显，黑头病部位呈蜂窝状且有黏稠黑汁状物质。国内外有些研究学者认为果蔬表皮易产生是黑斑病（black spot disease），也有研究学者称它为顶腐病（blossom-endrot）。但作者认为黑头病与黑斑病是有区别的，黑斑病只是表皮产生黑色或深褐色病斑，果肉完好，这与黑头病的症状不一样。WANG Y B等[2]研究了在鸭梨采收前，每年用外源水杨酸处理鸭梨5～10次，能有效防治鸭梨黑斑病的发生。日本冈山县是日本有名的水果产地（包括葡萄、桃、梨等），自1989年以来NASU H[3]对桃的黑斑病研究表明，发病与开花后的20 d第一次出现，病果率不断增加直到套袋，而树枝上的病症发病于五月中下旬迟于叶或果实发病。与本文中所研究的“黑头病”的发病状态有很大的不同。迄今为止关于本研究的病害报道甚少，因此，对库尔勒香梨采后贮藏期间黑头病致病菌生物学特性的进行研究，了解并确定致病菌的最适生长条件，可为黑头病发病规律、病害防治及库尔勒香梨长期贮藏提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多主枝孢菌（Cladosporium herbarumLink）：由病果分离、纯化及进行鉴定得到。

试验所用培养基配制参见《植物病害研究方法》[4]。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

胡萝卜葡萄糖琼脂培养基：胡萝卜200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

水琼脂（water agar，WA）培养基：20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL；

察氏培养基（Czapek’sagar）：葡萄糖30g，NaNO30.3g，K2HPO40.1 g，KCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，琼脂1.8 g，蒸馏水1 000 mL。

梨果汁培养基[5]：将新鲜的库尔勒香梨榨汁，取20 mL，将其总体积补足至100 mL，加入1.8 g琼脂。

上述培养基pH自然，在115℃条件下湿热灭菌20 min后备用[6]。

可溶性淀粉：天津市博奥化工有限公司；蔗糖：天津永晟精细化工有限公司；葡萄糖：天津盛奥化学试剂有限公司；乳糖：天津兴复精细化工研究所；麦芽糖：上海蓝季科技发展有限公司；甘露糖：上海蓝季科技发展有限公司；甘油：天津致远化学试剂有限公司；硝酸钠：天津天达净化材料精细化工厂；硝酸铵：成都市科龙化工试剂厂；硫酸铵：上海试剂四厂；氯化铵：天津百世化工有限公司；蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；尿素：天津大茂化工试剂厂；酵母浸膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；NaOH：天津永晟精细化工有限公司；HCl：北京化工厂；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZXSD-1160数显不锈钢电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅医疗设备厂；SW-CJ-ICV超净工作台：苏州安泰空气技术公司；MOTIC B SERIES生物显微镜：Motic有限公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基对采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢的影响[7]

无菌条件下在已活化的致病菌菌落边缘取直径为5 mm菌丝块[8]，将菌丝块分别接种于新鲜PDA、胡萝卜葡萄糖琼脂培养基、WA培养基、梨汁培养基、察氏培养基，在25℃条件下倒置培养。自第7天起每天测量菌落直径（采用十字交叉法[9]）。10 d后用直径5 mm的打孔器每个平板打取3个菌丝块，于10 mL 0.1%的吐温-80中，混合均匀，用血球计数板计数，测其产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.2 碳源对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢子量的影响[10-11]

以PDA培养基为基础培养基，分别添加20.0 g可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘油，其他成分不变配制成不同碳源的培养基，以不加碳源的PDA培养基为对照。将菌菌丝块接种在各培养基上，于25℃条件下培养。7 d和10 d后测菌落直径并观察产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.3 氮源对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢量的影响[12]

以察氏培养基为基础培养基，分别添加3.00 g硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、尿素、酵母浸膏，其他成分不变配制成不同氮源的培养基，以不加氮源的察氏培养基作为对照。于25℃条件下培养。7 d和10 d后测菌落直径并观察产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.4 温度对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢量的影响[13]

取菌丝块，分别移至新鲜灭菌的PDA平板上。将其分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃的恒温培养箱中倒置培养。7 d和10 d后测菌落直径并观察产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.5 pH对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢量的影响[14]

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调PDA培养基的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，取菌饼分别接种在PDA培养基中央，于25℃条件下倒置培养。7 d和10 d后侧菌落直径并观察产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.6 光照对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长量及产孢量的影响[15-16]

取菌丝块接种在新鲜PDA培养基中央（直径100mm），光照条件设置为完全光照、12 h光照黑暗交替、完全黑暗，均在25℃条件下培养。7 d和10 d后测菌落直径并观察产孢量。每种处理做3个平行。

1.3.7 分生孢子致死温度的测定

用无菌水配制孢子悬浮液分装于已灭菌的试管中，水浴加热，温度升至预定值时开始计时，保温10 min（预热1 min）。温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃[15]。吸取0.1 mL培养液到新鲜的PDA培养上涂布，25℃条件下倒置培养，每日观察致病菌的菌落生长情况。每个处理做3个平行。

1.3.8 分生孢子抗紫外能力的测定[18]

配制孢子悬浮液，吸取0.1 mL孢子悬浮液接种于新鲜PDA培养基上，涂匀。在超净工作台中，分别用紫外线照射1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，以不处理为对照。在25℃条件下培养8d，统计单菌落个数。每种处理做3个平行。分析致病菌对紫外线敏感性差异，致死率计算公式如下：

1.3.9 数据分析

采用SPSS17.0统计分析软件进行处理，多重比较采用LSD和Duncan方法。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢的影响

不同培养基对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢的影响结果见表1。

表1 培养基对黑头病致病菌菌丝生长及产孢的影响Table 1 Effect of different mediums on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表1可知，在试验的5种培养基中，梨汁培养基上菌丝生长最快，培养7 d和10 d后菌落直径分别为6.37 cm和8.20 cm，其次为PDA，在WA上生长最慢，培养10 d后仅为4.47 cm。在5种培养基上均可产生孢子，鉴于经济考虑PDA为该致病菌培养的最佳培养基。

2.2 碳源对香梨采后致病菌的菌丝生长及产孢量的影响

碳源对香梨采后致病菌的菌丝生长及产孢量的影响结果见表2。

表2 碳源对致病菌菌丝生长及产孢量的影响Table 2 Effect of different carbon sources on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表2可知，致病菌在7种碳源上菌丝均可生长，其中葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖培养7 d和10 d后菌落直径与其他碳源差异显著或极显著性，并且与对照差异极显著。蔗糖、甘油、乳糖对菌丝生长无显著差异；麦芽糖、甘露糖不利于菌丝生长。结果表明，葡萄糖有利于分生孢子的生长，并且与其他碳源差异极显著，是该致病菌培养的最佳碳源。

2.3 氮源对香梨黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响

氮源对香梨采后致病菌的菌丝生长及产孢量的影响结果见表3。

由表3可知，培养7 d和10 d后，蛋白胨、酵母膏、氯化铵有利于菌丝生长，培养7 d后菌落直径为6.07 cm、6.03 cm和5.83 cm，且三者差异不显著（P＞0.05）；与对照差异极显著。硝酸铵、硝酸钠和尿素不利于致病菌菌丝生长与其他氮源及对照差异极显著。蛋白胨有利于分生孢子的产生，并且与其他氮源及对照差异极显著，是该致病菌培养的最佳氮源。

表3 氮源对致病菌菌丝生长及产孢量的影响Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelium growth and sprulation of the pathogen

2.4 温度对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响

温度对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响结果见表4。

表4 温度对致病菌菌丝生长及产孢量的影响Table 4 Effect of different temperatures on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表4可知，5～35℃时致病菌均可以生长，20～30℃为致病菌适宜生长温度，最适宜温度为28℃。＞35℃或＜15℃致病菌菌丝生长较慢。10～35℃均可产生孢子，5℃和40℃未见有孢子产生；28℃有利于分生孢子的产生，且与其他温度差异极显著。

2.5 pH对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响

pH对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响结果见表5。

表5 pH对致病菌菌丝生长及产孢量的影响Table 5 Effect of different pH on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表5可知，致病菌菌丝在pH 3～11条件下均可以生长，适宜的pH值为5～8，最适宜的pH值为7，菌丝生长适宜环境为中性偏酸性。pH 3～11均有孢子产生，适宜产孢子环境的pH值为6，且与其他pH差异显著。

2.6 光照对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响

光照对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量的影响结果见表6。

表6 光照对致病菌菌丝生长及产孢量的影响Table 6 Effect of different light conditions on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表6可知，致病菌菌丝在完全光照、光暗12 h交替、完全黑暗条件下均可正常生长，培养10d后菌落直径分别为8.07cm、7.63 cm和6.67 cm，完全光照与完全黑暗差异极显著。因此，致病菌对光照较敏感。完全光照、光暗12 h交替和完全黑暗3个处理，均有孢子产生，完全光照有利于孢子的产生，更适合致病菌菌丝生长。

2.7 分生孢子的致死温度

分生孢子在不同温度处理条件下的孢子致死率结果见表7。

表7 不同温度处理条件下分生孢子的萌发率Table 7 Spore germination rate of the pathogen treated at different temperature

由表7可知，首先在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃在恒温水浴锅中处理孢子悬浮液10 min后，然后在25℃恒温培养24 h后，孢子萌发率分别为43.3%、32.67%、4.67%、0、0、0，并且相互之间差异极显著。温度升至≥55℃水浴10 min，分生孢子无一萌发。说明55℃在水浴中加热10 min可致死致病菌孢子。

2.8 致病菌分生孢子抗紫外能力的测定

致病菌分生孢子抗紫外能力的试验结果见表8。

表8 分生孢子的抗紫外能力Table 8 Anti-UV ability of conidium

由表8可知，紫外线辐照处理1min、3min、5min、7min、9 min后分生孢子致死率分别50%、80.67%、90%、91%、94%。辐照9 min分生孢子致死率最高，且与其他辐照时间差异极显著。结果表明，辐照处理时间越长，分生孢子致死率越高，与李自芹等[18]研究结果一致。

3 结论

本试验研究发现，环境对香梨采后黑头病致病菌菌丝生长及产孢量有很大的影响。菌丝生长以PDA培养基最佳；菌丝生长最适温度为28℃；最适pH值为7。完全光照的光照条件有利于菌丝生长及分生孢子的产生量。在所供试的碳源中，葡萄糖有利于致病菌菌丝生长及分生孢子的产生，供试氮源中蛋白胨最佳。55℃为致病菌分生孢子的致死温度。紫外辐照9 min后致病菌的分生孢子致死率为94%。

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Biological characteristics of“black disease”pathogen duringPyrus bretschneideriRehd storage

YANG Yan,CHEN Guogang*
(College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

DuringPyrus bretschneideriRehd storage,the optimum mycelium growth of the“black disease”pathogen was at 28℃and pH 7.The PDA medium and pear juice medium were the most conducive to mycelium growth and sporulation.Effects of carbon and nitrogen sources on mycelium growth and sporulation were significant,and the optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone,respectively.Conidium was sensitive to light,and full lighting was favorable for mycelium growth and sporulation.Pathogen conidium lethal condition was 55℃water bath for 10 min.The longer time of UV irradiation resulted in the higher lethal rate of conidium.

Pyrus bretschneideriRehd;biological characteristics;conidium

Q93-3

A

0254-5071（2014）11-0101-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.023

2014-10-12

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室开发基金（SKLF-KF-201208）；石河子大学高层次人才科研启动（RCZX201222）

杨焱（1987-），女，硕士研究生，研究方向为果蔬贮藏与保鲜的科研工作。

*通讯作者：陈国刚（1977-），男，副教授，博士，研究方向为果蔬贮藏与保鲜科研工作及教学。