ROCK抑制剂Y-27632对TGF-β1介导的A549细胞上皮—间质转化的抑制作用

李 岩，吴爱萍，周海英，吕 铮，高 杨，任淑华

(1唐山市工人医院，河北唐山063000;2河北联合大学基础医学院)

肺癌是常见的恶性肿瘤，其发病率及病死率很高，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的70%～80%，且70%以上的患者确诊时已失去手术机会，即使采用放、化疗等综合治疗仍不能提高其生存率。最近研究表明，上皮—间质转化(EMT)可能在肿瘤的发生、发展(尤其是侵袭和转移)中发挥重要的调控作用，其可能是肿瘤侵袭和转移的始动因素，且与肿瘤干细胞、肿瘤放化疗抵抗和耐药密切相关［1］。Ras同源物GTP酶(Rho)信号与肿瘤的侵袭和转移关系密切，现已证实，其下游特征性效应器Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)参与细胞的收缩、迁移、增殖和凋亡等过程［2，3］。2012年，我们观察了ROCK阻断剂Y-27632对转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的NSCLC A549细胞EMT的调节作用，旨在探讨Y-27632对TGF-β1介导的A549细胞EMT的抑制作用，为开发新的肿瘤抑制药物Y-27632提供一定的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC A549细胞购自中科院上海细胞库，Y-27632购自Cayman chemica公司，TGF-β1购自Peprotech公司;E-钙黏蛋白一抗、波形蛋白一抗、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)一抗、ROCK-I一抗购自Epitomics公司;血清应答因子(SRF)一抗、心肌相关转录因子-A(MATF-A)一抗购自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞诱导与分组 A549细胞常规培养并传代，待细胞密度为60%左右时进行实验。实验分为3组，对照组在含0.2%FBS的DMEM培养条件下进行实验;TGF-β1组在含0.2%FBS的DMEM培养条件下，加入5 ng/mL的TGF-β1诱导;Y-27632组在含0.2%FBS的DMEM培养条件下，先给予Y-27632 10 μmol预孵育1 h，再加入5 ng/mL的TGF-β1诱导［4］。在倒置显微镜下进行细胞形态观察并拍照。

1.2.2 划痕实验检测细胞迁移 将细胞按2× 104/孔种植于24孔板，待次融合状态后，用200μL枪头在其孔中央轻轻划痕，每组8孔，48 h后在倒置显微镜下进行细胞形态观察并拍照。采用IPP 6.0图像分析软件测算划痕区面积，计算迁移率，迁移率越高，迁移能力越强。

1.2.3 免疫细胞化学染色检测波形蛋白、α-SMA表达 常规制备细胞爬片［5］，采用枸橼酸盐高压热修复，波形蛋白一抗、α-SMA一抗稀释比例为1∶300，4℃过夜;二抗37℃孵育20 min，镜下控制DAB显色，轻度复染。

1.2.4 Western blot法检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、α-SMA、ROCK、SRF、MATF-A表达 采用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA法检测各蛋白水平，按照50μg/泳道上样，常规行电泳及电转。一抗4℃过夜，二抗37℃孵育1 h，行BCIP/NET显色，至出现明显条带后用纯水终止。采用IPP 6.0图像分析软件计算条带平均光密度值(OD)，经内参平衡后作为蛋白的定量分析。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，进行完全随机设计的单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组EMT 中A549细胞的形态变化和迁移率比较 对照组作用48 h后，A549细胞形态未见明显变化，细胞连接紧密，折光性强。TGF-β1组诱导48 h后，A549细胞形态由原来的铺路石样变为长梭样或纺锤体形，细胞连接消失，间隔增大，细胞间呈离散趋势，并随时间延长而变化显著。Y-27632组干预后能显著抑制上述A549细胞变化，细胞形态基本保持原来形态，细胞间具有折光性强的细胞连接，细胞相互融合，呈铺路石样。3组A549细胞迁移率比较见表1。

表1 各组EMT中A549细胞迁移率比较(%，±s)

表1 各组EMT中A549细胞迁移率比较(%，±s)

注:与对照组同期比较，*P＜0.05;与TGF-β1组同期比较，#P＜0.05

组别A549细胞迁移率24 h 48 h对照组30.33±5.09 64.17±4.88 TGF-β1组 60.83±5.27* 87.67±3.33* Y-27632组 41.83±4.02# 77.17±3.43#

2.2 3组EMT中A549细胞的波形蛋白、α-SMA、E-钙黏蛋白表达比较 免疫细胞化学染色显示，对照组无波形蛋白、α-SMA阳性表达，TGF-β1组可见波形蛋白、α-SMA阳性表达，Y-27632组能抑制波形蛋白、α-SMA阳性表达。Western blot检测显示，与对照组比较，TGF-β1组E-钙黏蛋白表达下调，波形蛋白、α-SMA表达上调(P均＜0.05)。与TGF-β1组比较，Y-27632组E-钙黏蛋白表达上调，波形蛋白、α-SMA表达下调，分别是TGF-β1组的52.05%、55.65%(P均＜0.05)。见表2。

表2 3组EMT中A549细胞各蛋白表达水平比较(OD，±s)

表2 3组EMT中A549细胞各蛋白表达水平比较(OD，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与TGF-β1组比较，#P＜0.05

组别 E-钙黏蛋白 波形蛋白 α-SMA ROCK SRF MATF-A对照组 0.48±0.04 0.25±0.06 0.80±0.20 0.18±0.03 0.36±0.11 0.25±0.04 TGF-β1组 0.19±0.06* 0.73±0.19* 2.48±0.56* 0.66±0.24* 0.83±0.09* 0.84±0.27* Y-27632组 0.38±0.09# 0.38±0.09# 1.38±0.30# 0.29±0.03# 0.46±0.14# 0.37±0.03#

2.3 3组EMT中A549细胞ROCK、SRF、MATF-A表达比较 Western blot法检测结果显示，TGF-β1组能活化ROCK、SRF、MATF-A表达，其表达分别是对照组的3.67、2.31和3.36倍，差异有统计学意义(P均＜0.05);而Y-27632组则能下调ROCK、SRF、MATF-A表达，其表达分别是 TGF-β1组的0.44、0.55和0.44倍，差异有统计学意义(P均＜0.05)。

3 讨论

目前研究认为，EMT是肿瘤上皮细胞浸润、转移的重要机制，是上皮细胞获得运动、迁移能力的主要调控手段。EMT的主要特征为上皮标记物如E-钙黏蛋白等表达缺失或异位表达，而间质标记物如波形蛋白、α-SMA等出现或表达上调;上皮细胞失去原有极性，由顶—底极性变为前—后极性，即具有迁移的能力;体外培养可见上皮细胞由铺路石样变为梭形的成纤维细胞样形态，伴有伪足形成［6］。本研究发现，TGF-β1诱导后A549细胞连接消失，细胞形态由铺路石样变为长梭形，同时迁移能力提高，E-钙黏蛋白表达下调，波形蛋白、α-SMA表达上调，与文献报道［6］相似，提示TGF-β1能显著促进A549细胞发生EMT。

有研究显示，ROCK在诱导细胞张力纤维丝形成中发挥重要的调控作用，其能促进球状肌动蛋白(G-actin)聚合为纤维状肌动蛋白，解聚MATF-A与G-actin的复合物，促进 MATF-A转位入核，作为SRF的转录辅因子，促进其转录调控作用，并促进其靶基因α-SMA转录［7］。在肿瘤细胞中，SRF过表达能使肿瘤上皮细胞获得间质表型，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭;基因沉默或下调SRF表达能抑制肿瘤细胞的迁移力、侵袭力和运动力［8，9］;针对SRF及其转录辅因子MRTF-A的siRNA能通过下调细胞的扩散、黏附和运动能力，减少肿瘤细胞的恶性潜能［10］。提示ROCK介导的SRF/MATF-A转录调控可能是肿瘤细胞发生EMT的重要机制之一，阻断ROCK可能对EMT发生具有一定抑制作用。

目前研究发现，Y-27632具有多种药理学作用，包括平喘、降压、抗炎，以及对缺血再灌注损伤、神经系统疾患的抑制作用，其对肿瘤细胞的凋亡、黏附、迁移也有抑制作用［4，11］。本研究显示，Y-27632干预后能通过阻断ROCK/SRF/MATF-A调控的间质表型表达，抑制TGF-β1介导的A549细胞的EMT进程，提示Y-27632可能具有潜在抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用。

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