基因芯片技术快速诊断颅内细菌感染临床应用*

崔益秋，居兴云，姜素兰，张春秀

（1海安人民医院神经外科，江苏226600；2生物芯片上海国家工程研究中心）

基因芯片技术快速诊断颅内细菌感染临床应用*

崔益秋1，居兴云1，姜素兰1，张春秀2

（1海安人民医院神经外科，江苏226600；2生物芯片上海国家工程研究中心）

目的：探讨基因芯片技术在快速诊断颅内细菌感染的临床应用。方法：选择金葡菌，肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，肺炎双球菌4种常见致病菌的特异DNA序列，设计相应的引物与探针。对颅内感染30例脑脊液培养阳性12例，阴性18例标本行多重PCR扩增、基因芯片检测，进行菌种鉴定与脑脊液细菌培养结果比较。结果：（1）细菌培养阳性脑脊液标本12例中，基因芯片鉴定出金黄色葡萄球菌5例，肺炎克雷伯菌3例，大肠杆菌2例，肺炎双球菌2例。（2）细菌培养阴性18例中，基因芯片鉴定出金葡菌1例，大肠杆菌2例；检出16S基因8例，未鉴定出菌种，未检出16S基因7例。结论：基因芯片可灵敏、快速诊断出颅内感染患者脑脊液中致病菌。

颅内感染；脑脊液；基因芯片；多重聚合酶链反应；金黄色葡萄球菌；肺炎克雷伯菌；大肠杆菌；肺炎双球菌

长期以来临床上颅内感染的病原学检测主要是靠脑脊液细菌培养，由于细菌培养所需时间长，如结核杆菌甚至需要几周[1-2]，且由于抗生素应用等诸多因素影响，脑脊液细菌培养阳性率不足10%。因此，目前病原学检查方法明显滞后于临床。基因芯片技术具有快速、高效、高通量分析等特点[3]。我们2012 年1月—2013年8月收集颅内感染患者的脑脊液标本30例，选择4种典型颅内感染致病菌，根据其特异DNA序列设计并制备小型基因芯片，探讨基因芯片技术在颅内感染检测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 颅内感染患者脑脊液标本30例，其中经脑脊液培养确诊12例中，金黄色葡萄球菌5例，肺炎克雷伯菌3例，大肠杆菌2例，肺炎双球菌2例。细菌培养阴性者18例。颅内细菌感染的临床诊断参考Harrison标准[4]。兼顾革兰阳性及阴性菌、球菌与杆菌，选取金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌以及肺炎双球菌为检测对象。

1.2 方法

1.2.1 脑脊液细菌培养：接种环挑取浑浊脑脊液，接种于血琼脂平板及巧克力琼脂平板上，在35℃，5% CO2培养箱培养24h涂片检查。

1.2.2 脑脊液DNA摄取：（1）脑脊液样本2mL，以8 000g离心10min（离心半径7cm，快速9 000r/min），弃上清；（2）灭菌生理盐水悬浮沉淀，8 000g离心10min，弃上清；（3）加入DNA裂解液180μL，37℃温浴30min；（4）加入25μL蛋白酶K，56℃温浴30min；（5）加乙醇200μL，采用离心柱提取样本DNA。

1.2.3 引物设计与探针合成：从Genbank中筛选出4种细菌的特异DNA序列。用Primer Premier 5.0软件设计出PCR引物及探针（表1），同时选择所有细菌共有的16S基因设计引物和探针作为阳性参照。由上海Invitrogen公司合成。

1.2.4 多重PCR：进行微生物检测，以实验用水为阴性对照。反应体系：缓冲液（10×）1.5μL，dNTP （10mmol/L）0.2μL，DNA（20ng/μL）1.0μL，Taq酶0.2μL，引物（20μmol/L）0.2μL×2，MgCl2（25mmol/L）0.6μL，H2O 11.1μL，共15μL。Tm：56℃，循环30次。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳（2%琼脂糖，电压150V，电泳时间15min）观察条带。

1.2.5 基因芯片制备：合成的寡核苷酸Oligo用点样液稀释到50mmol/L后，加入384孔板中，每孔10μL。在湿度60%、温度25℃条件下，通过接触式点样将探针点载到醛基化片基上。点样矩阵为10×7，各位点随机排布，每个探针位点重复3次（图1）。基因芯片由上海生物芯片公司点制，置于干燥箱保存。1.2.6 结果判定：用GenePix Pro 6.0软件提取每个探针位点的荧光信号强度值，去除低信号位点，高于cutoff值（SNR=3.0）的探针信号视为有效信号。

表1 多重PCR引物及芯片杂交探针序列

2 结 果

2.1 菌种基因检测结果 设计引物扩增相应基因靶序列后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见相应大小的清晰条带（图1）。

图1 菌种基因检测的PCR产物电泳图

2.2 基因芯片鉴定菌种 多重PCR产物与特异性探针杂交后，在基因芯片上相应位点显示出绿色荧光（图2），鉴定出细菌种类，而阴性对照无荧光显示。

2.3 细菌培养阳性的脑脊液标本12例通过基因芯片均鉴定出菌种，其中金黄色葡萄球菌5例，肺炎克雷伯菌3例，大肠杆菌2例，肺炎双球菌2例，与细菌培养结果一致。细菌培养阴性的18例标本中鉴定出菌种3例，其中金黄色葡萄球菌1例，大肠杆菌2例；检出16S基因8例，未鉴定出菌种，未检出16S基因7例。

图2 基因芯片鉴定菌种

3 讨 论

细菌培养阳性12例标本均鉴定出脑脊液培养一致的菌种，培养阴性的18例标本中，有11例检测出16S基因，证明细菌感染的存在。说明基因芯片技术比传统脑脊液培养敏感，其中8例只检出了16S基因，但未能鉴定出细菌种类，可能是病原菌不在我们设计的4个药种中。有阳性菌种鉴定结果的15例标本均未出现其他鉴定结果，说明基因芯片技术有很高的特异性。多重PCR具有高效性、系统性及经济方便性，可同时检测多种病原菌[5]，基因芯片可一次针对大量样品进行分析和检测[6]。由此在该实验中，将2种技术相结合进行颅内细菌感染的检测，所有实验可在24h内完成，说明基因芯片技术适用于颅内细菌感染的病原菌快速检测。

本次实验已经证实，基因芯片技术较传统脑脊液细菌培养具有快捷、灵敏等优势，适用于各级医院，通过多重PCR和基因芯片技术进行细菌种类检测为颅内感染病原菌检测提供了早期、快速、敏感的有效方法。并可极大提高颅内感染临床诊治水平，降低颅内感染所致病残率和病死率。随着基因芯片的发展，针对颅内感染这样的细菌培养阳性率低的疾病，基因芯片检测将有很好的临床应用价值。

[1]张瑞梅，刘成永，申涛，等.基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性［J］.淮海医药，2009，27（1）：5-6.

[2]Cheung VG，Morley M，Aguilar F，et al.Making and reading microarrays［J］.Nat Genet，1999，21（1 Suppl）：15-19.

[3]赵继宗，王孝蓉.应用抗菌药物防治外科感染的指导意见（草案）XII——神经外科感染的防治［J］.中华外科杂志，2004，42（13）：823-825.

[4]Gupta S，Bandyopadhyay D，Paine SK，et al.Rapid identification of mycobacterium species with the aid of multiplex polymerase chain reaction（PCR）from clinical isolates［J］. Open Microbiol J，2010，4：93-97.

[5]Palka-Santini M，Puetzfeld S，Cleven BE，et al.Rapid identification，virulence analysis and resistance profiling of Staphylococcus aureus by gene segment-based DNA microarrays：Application to blood culture post-processing［J］.J Microbiol Methods，2007，68（3）：468-477.

R651.1

B

2014-11-03

1006-2440（2014）06-0616-03

南通市社会发展科技计划项目（S10935）。