2012年宁夏H5N1亚型高致病性禽流感疫情回顾性调查

刘华雷，王晓亮，Ricardo J Soares Magalhães，李知新，周小燕，王静静，赵云玲，郑东霞，David Castellan，黄保续，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；

2.宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011；

3.澳大利亚昆士兰大学公共健康学系，澳大利亚昆士兰；

4.联合国粮食及农业组织跨界动物疫病应急中心中国办公室，北京 100600；

5. 联合国粮食及农业组织亚太区域办公室跨界动物疫病应急中心，泰国曼谷）

2012年宁夏H5N1亚型高致病性禽流感疫情回顾性调查

刘华雷1，王晓亮2，Ricardo J Soares Magalhães3，李知新2，周小燕4，王静静1，赵云玲1，郑东霞1，David Castellan5，黄保续1，王志亮1

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；

2.宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011；

3.澳大利亚昆士兰大学公共健康学系，澳大利亚昆士兰；

4.联合国粮食及农业组织跨界动物疫病应急中心中国办公室，北京 100600；

5. 联合国粮食及农业组织亚太区域办公室跨界动物疫病应急中心，泰国曼谷）

[目的]2012年4月，宁夏当地报告蛋鸡发生疑似H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）疫情。为解本次疫情的流行病学特征、分析导致疫情发生的风险因素，在疫情发生后我们与当地兽医有关部门联合开展了回顾性暴发调查。[方法]以发生疫情的固原市头营镇所有的87个蛋鸡养殖场作为研究对象，采用问卷调查和抽样检测相结合的方式。对发病场采集病鸡的病料样品采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或病毒分离来检测H5N1亚型禽流感病毒。采用多元回顾分析对疫情发生的风险因素进行研究，通过半方差图分析来证实发病场的聚集性分布。[结果]调查表明：H5N1疫情在头营镇分布广泛，其中有45户养殖场H5N1病毒RT-PCR呈阳性，其中4个养殖场病毒分离呈阳性。多变量模型分析表明：对废弃物不进行无害化处理（调整后的比值比OR为2.7，95% 置信区间 = 1.20-8.30）和在疫情发生前一个月内有外来人员来访（调整后的比值比 = 5.5，95%置信区间= 1.97-15.64）等两个因素可能与本次高致病性禽流感疫情有关。[结论]因此，频繁的人员流动和没有对废弃物进行无害化处理可增加感染发生的风险。为预防H5N1亚型HPAI感染的发生，应加强生物安全管理措施，包括限制外来人员来访和强化废弃物无害化处理等。

高致病性禽流感；H5N1；暴发调查

近年来H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）在全球很多国家呈地方流行。我国于2004年1月27日首次报告发生H5N1高致病性禽流感疫情，随后在2004年全年共发生49起疫情，扑杀家禽902余万羽[1，2]。近年来通过持续的监测表明我国目前流行的H5亚型高致病性禽流感病毒主要包括clades 7、2.3.4和2.3.2等三种[3]。为防控高致病性禽流感，采用了强制免疫与扑杀相结合的防控策略[4]。目前普遍使用的H5亚型高致病性禽流感疫苗主要包括Re-4、Re-5 和Re-6等三种，分别对应于clades 7，2.3.4和2.3.2等三种不同的流行毒株[5]。在对易感家禽进行免疫后，H5亚型HPAI疫情暴发的次数逐年显著下降。但近年来通过基于风险的病原学主动监测，在部分地区的活禽市场仍可检测到H5亚型高致病性禽流感病毒，部分地区还存在免疫带毒现象，同时在部分地区还存在散发。由于普遍免疫带来的选择压力导致我国H5亚型高致病性禽流感病毒突变的频率大大增加，抗原漂移和抗原转变等两种禽流感病毒的变异方式时有发生[6-7]。

宁夏是我国北方蛋鸡主产区之一，于2006年首次报告发生H5N1亚型高致病性禽流感疫情，导致这次疫情的H5N1病毒属于clade 7。自此以后，为了防控H5N1疫情暴发，当地政府普遍采用了Re-4 疫苗。2012年4月13日，宁夏固原市原州区头营镇的几个养殖户向当地兽医部门报告发生疑似HPAI疫情。农业部在4月18号确认了本次HPAI疫情。通过对导致此次疫情发生的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因（HA）进行遗传进化分析，结果证实分离的H5N1病毒属于clade 7.2，与Re-4疫苗株HA基因的同源性仅为94.1%[8]。为了解这次疫情的流行病学分布，分析导致疫情发生和扩散可能的风险因素，我们开展了一次回顾性暴发调查。

1 方法

1.1 暴发调查

在本年固原市原州区头营镇最后一起HAPI疫情报告四周后与当地兽医机构联合开展暴发调查。采用调查问卷对该镇所有养禽场进行现场调查，头营镇所有的养禽场地理位置信息通过采用手持的GPS设备（UniStrong，北京）进行测定，采用ArcGIS 10 （ESRI）进行分析。对疑似发生HPAI疫情的养禽场采集了5只病鸡的组织病料和棉拭子样品，采用RT-PCR和病毒分离进行实验室检测。

1.2 病例定义

疑似病例：头营镇蛋鸡养禽场在3月份以来，出现急性死亡、产蛋下降、扭颈劈叉等神经症状、头部水肿、脚鳞出血、鸡冠出血或发绀等临床症状之一或全部，同时H5N1病毒RT-PCR检测呈阳性。

确诊病例：H5N1亚型禽流感病毒分离呈阳性的疑似病例。

1.3 风险因素分析

采用横断面研究方法对调查涉及的风险因素进行分析，所有头营镇确定的疑似病例和确诊病例作为病例，其余未感染的养禽场则作为非病例。所有的风险因素均采用卡方或Fisher精确检验进行测试。

对生物学有意义的一阶交互作用项也进行了检验。对可能的因素之间的相关性采用皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation coeffcient）进行评估。然后对所有p值小于0.2的所有因素采用多变量Bernoulli线性回归模型进行分析。分析采用统计软件Stata version 11 （Stata公司，College Station，Texas）进行。

1.4 空间分析

采用多变量模型中分析的变量在多变量分析模型中残差的半方差图来定量评价空间分布的依赖程度[9]。半方差图是通过检验各观察点的变异与分布位置的关系，以图形的形式描述不同位置的变量分布差异。采用R软件（version 2.10.0）geoR程序包来构建残差的半方差图。

2 结果

2.1 描述流行病学

头营镇所有的养禽场均为蛋鸡养殖场。在所有的87户养殖场中，45户为疑似感染场（51.7%）。对其中的4户疑似感染场进行了病毒分离，结果均分离出H5N1亚型高致病性禽流感病毒。通过对病毒HA基因的遗传进化分析表明此次疫情分离株属于clade 7.2[8]. 45个感染场和42个非感染场地理分布见图1。

通过调查发现，最早出现的指示病例在2012年3月28日开始表现大面积突然死亡等临床症状，随后感染发病场数量迅速增加，到2012年4月9日新增疑似感染场达到顶峰，随后新增发病场数量逐渐减少，最后一起病例发生在2012年5月9日。本次疫情的流行曲线见图2。

最早发病的指示病例感染场一共饲养了三批蛋鸡，除了最早感染的批次为用H5亚型禽流感疫苗免疫之外，其余两个批次均先后采用H5亚型禽流感疫苗Re-4和Re-5二联苗免疫过。通过对45个发病场进行调查发现，最常见的临床症状包括：精神萎靡不振，采食下降，产蛋下降和急性死亡（详见表1）。在所有发病场中死亡率平均为17% （标准差SD为3.0%）。指示病例中未免疫的禽群死亡率最高，达到83.3%。

表1宁夏2012年H5N1禽流感疫情临床症状分布（n=45）

图1 2012年宁夏H5N1疫情地理分布

图2 2012年宁夏H5N1疫情流行曲线

2.2 感染相关因素分析

对调查问卷涉及的所有风险因素进行了单变量分析，结果显示H5N1感染与废弃物或病死禽未进行无害化处理、蛋盘未进行消毒和具有外来人员来访等因素有关（详见表2）。其中废弃物无害化处理和病死禽无害化处理两个因素高度相关（r2=0.9）。

在多变量分析模型中，选择了废弃物无害化处理和具有外来人员来访两个因素进行分析。结果显示H5N1感染场与未感染场相比，废弃物未进行无害化处理造成感染的风险高近3倍 （调整后的比值比OR= 2.7，95% 置信区间= 1.20-8.30），在暴发前1个月有外来人员来访造成感染的风险高5倍 调整后的比值比OR = 5.5，95%置信区间= 1.97-15.64）。2.3 疫情感染残差空间差异分析我们发现在多变量模型中分析的变量仅占感染场聚集性分布的20% （图3）。这表明养禽场之间距离较近可能是导致这些养禽场迅速传播的原因。

表2 2012年宁夏H5N1高致病性禽流感疫情的单变量风险因素分析

图3 2012年宁夏H5N1高致病性禽流感疫情多变量分析模型中残差的半方差图

3 讨论

本研究中涉及的宁夏固原市原州区头营镇H5N1亚型高致病性禽流感疫情通过病毒分离进行了确诊。我们通过调查，发现本次疫情扩散范围广，在这次疫情流行过程中，45户发病场通过RTPCR证实了H5亚型高致病性禽流感病毒的感染，对其中的4个养殖场采用病毒分离结果均成功分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。

禽流感病毒发生变异的方式主要包括抗原漂移和抗原转变两种，其中抗原漂移是最常见的一种变异方式，然而近年来不同亚型禽流感病毒之间发生片段重组的情况时有发生，如H5N1亚型禽流感病毒与H9N2亚型禽流感病毒之间发生重组形成H5N2亚型高致病性禽流感病毒等[10-13]。一些新重组出现的变异株也导致了部分地区高致病性禽流感疫情的散发。然而，通过对本次疫情流行过程中分离到的H5N1亚型禽流感病毒进行基因组分析测序分析发现，导致本次疫情暴发的病毒并没有发生基因重组现象，仍为H5N1亚型。近年来持续的监测表明，国内流行的Clade 7类型的H5N1亚型禽流感病毒一直在不断地进化，这种新近流行的病毒与往年流行的病毒在抗原性上可能已经发生明显的抗原漂移。基因序列分析表明本次疫情分离株与目前普遍使用的Re-4疫苗主要基因供体A/chicken/Shanxi/2/2006（H5N1）毒株HA基因核苷酸的同源性仅为94.1%[8]。本次流行的H5N1亚型禽流感病毒在HA1抗原位点区一些关键位点氨基酸的替换导致了流行毒株和疫苗株的变异，如K53E，K115E，S121H，E126N，A127T，G139E，K140N，T167A，D183N，K189M 和T195N等，可能改变病毒的抗原性。我们通过采用SPF鸡制备疫苗株的单因子血清，采用血凝抑制试验来分析其抗原性差异，结果显示用疫苗株作为抗原测定血清的抗体效价比用分离株测定的抗体效价高5个滴度[8]。因此，导致本次疫情暴发的流行毒株与疫苗株在抗原性方面可能存在显著差异，导致疫苗株免疫后对流行毒株的攻击不能提供完全保护。我国农业部也认识到clade 7的H5N1亚型高致病性禽流感病毒的变异趋势，目前正在考虑采用新的候选疫苗株来替代Re-4疫苗株以防控这种变异毒株。

在疫情暴发时进行早期预警和快速反应是降低疫病传播风险的关键。疑似疫情的延时报告可能会导致疫病迅速扩散，造成流行范围扩大。在本次疫情暴发过程中，我们通过调查发现首起病例出现大面积死亡时在2012年3月28日，可当地兽医机构在4月13日才接到疑似疫情发生的报告。没有及时对疑似疫情报告可能导致了这次疫情的迅速扩散。因此，应强化对养殖户及时报告疑似疫情的宣传培训，提高及时发现并报告疑似疫情的能力，增强防控意识。对异常死亡的家禽进行及时报告和调查将为兽医相关机构准确记录疫病详细信息，提高疫病关键信息的准确性，为分析疫病风险因素、降低疫情扩散的范围提供支持。

本研究证实养禽场的生物安全措施不完善是导致本次H5N1亚型高致病性禽流感疫情扩散的决定因素。对易感家禽采用H5N1亚型高致病性禽流感疫苗进行免疫可降低其易感性。一旦一个养禽场出现疑似H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染，必须立刻采取有效措施，如扑杀、隔离等，以降低疫情扩散蔓延的风险。在本次疫情流行过程中，指示病例所在的养禽场一个未及时采用H5N1亚型高致病性禽流感疫苗的批次出现高死亡率（83.3%）。该养殖户在未免疫鸡出现大面积死亡后，对其余两个批次的家禽采用了不合理的淘汰措施，结果导致了疫情的进一步扩散。在免疫家禽中，由于免疫抗体的存在可能导致在病毒感染早期出现的症状不典型或者不明显。因此，在一个养禽场如果一个批次的家禽确定感染的话，宜对该养禽场所有批次的家禽采取紧急措施，如隔离、扑杀、消毒等。此外，在不同养禽场之间应强化生物安全管理，建立相对隔离措施，对外来车辆进行消毒等，以降低疫病传入风险。村级防疫员、基层兽医或商贩等外来人员来访也是本次疫情传播的风险因素。因此，应限制外来人员来访、降低与家禽接触的几率也是降低疫情发生的措施之一。

由于本次暴发调查是一个回顾性调查，加上部分养殖户没有详细的养殖记录，因此调查过程中搜集的部分信息数据可能存在回忆性的偏倚。在暴发调查过程中信息搜集的准确性和完整性对数据的分析和结论至关重要。

致谢：感谢美国疾病预防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC） Pawin Padungtod博士对文章提出了许多重要的评价和建议。本次调查得到中国动物卫生与流行病学中心和宁夏动物疾病预防控制中心的大力支持。

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Investigation of Highly Pathogenic Avian Infuenza（H5N1）Outbreaks in Poultry in Ningxia，China，2012

Liu Hualei1，Wang Xiaoliang2，Ricardo J Soares Magalhães3，Li Zhilin2，Zhou Xiaoyan4，Wang Jingjing1，Zhao Yunling1，Zheng Dongxia1，David Castellan5，Huang Baoxu1，Wang Zhiliang1

（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032；2.Ningxia Animal Disease Prevention and Control Center，Yinchuan 750011；3.University of Queensland，Infectious Disease Epidemiology Unit，School of Population Health，Herston，Queensland，Australia；4. HPAI H5N1 Programme，Food and Agriculture Organization of the United Nations，Beijing 100600；5.Emergency Centre for Trans-boundary Animal Diseases，Food and Agriculture Organization of the United Nations Regional Offce for Asia and the Pacifc，Thailand）

In April 2012，there were reports of suspected highly pathogenic avian infuenza （HPAI） H5N1 among poultry layers in Ningxia. A retrospective investigation was conducted to describe epidemiological characteristics of the outbreak and identify risk factors for HPAI H5N1 infection. Questionnaires were delivered to all the 87 layer farms in Touying Town，Guyuan County，Ningxia Province，within four weeks following the last reported outbreak. Samplesof sick chickens were collected from 45 suspected farms to determine presence of H5N1 virus by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and confrmed by virus isolation. Multiple logistic regression analysis was used to identify the risk factors for infection and semivariogram analysis was used to demonstrate clustering of infected farms. Among 45 farms with positive PCR results，virus was isolated from four farms. Farms with improper waste disposal（adjusted OR = 2.7，95% CI = 1.20-8.30） and having visitors in farm within the past month （adjusted OR = 5.5，95% CI = 1.97-15.64） were signifcantly associated with HPAI infection. Frequent human movement into farms and improper waste management increased the risk of infection. Biosecurity practices，including limiting number of visitors and proper waste disposal，should be enhanced to prevent further H5N1 infection.

HPAI；H5N1；outbreak investigation

S862.65

：B

：1005-944X（2014）09-0057-05

王志亮

注：刘华雷，王晓亮，Ricardo J Soares Magalhães对本文有相同贡献