分泌抗金黄色葡萄球菌细菌素乳酸菌的分离鉴定

王全溪 许丽惠 邓红玉 吴雪珍 庄育彬 福建农林大学动物科学学院 福州 350002

分泌抗金黄色葡萄球菌细菌素乳酸菌的分离鉴定

王全溪 许丽惠 邓红玉 吴雪珍 庄育彬 福建农林大学动物科学学院 福州 350002

为分离和筛选产抗金黄色葡萄球菌乳酸菌素的优势乳酸菌，利用乳酸菌分离培养基MRS从收集的各种腌制菜汁中分离培养乳酸菌，通过细菌培养特性、革兰氏染色特点、生理生化特性初步鉴定，同时根据Genbank中乳酸菌的16S rDNA序列设计特异性引物，采用PCR方法进一步鉴定，并以金黄色葡萄球菌为指示菌对乳酸菌的发酵上清液进行抑菌特性研究。结果表明，从腌渍菜汁中分离获得90株产酸菌，通过形态学、生理生化特性和PCR鉴定，结果73株产酸菌为乳酸杆菌；分泌产物抑菌试验表明，有10株菌具有抑制金黄色葡萄球菌活性，经酸排除和过氧化氢排除试验，仍然有5株乳酸菌的分泌产物具有抑制金黄色葡萄球菌活性。可见，从腌渍菜汁分离到的乳酸菌具有抑制金黄色葡萄球菌活性的特性，主要是通过分泌乳酸菌素来发挥作用。

腌渍菜汁 乳酸菌 乳酸菌素 金黄色葡萄球菌 抑菌性

抗生素作为畜禽抑菌药物和促生长添加剂在畜牧业生产中得到了广泛应用。然而长期使用抗生素不但影响动物疾病的防治效果，还会产生抗药性和残留，造成严重的畜产品污染，有的甚至会诱发人和动物产生癌变和畸变，危及人类的健康与安全，如超级细菌[1]。因此，研制一种能改善畜禽健康、提高生产性能且安全无毒的能替代抗生素的饲料添加剂已成为动物营养研究的一个热点。

乳酸菌普遍存在于人和动物消化道、发酵食品中的一类兼性厌氧菌。乳酸菌除了利用其产生的有机酸外，现在还发现它可以产生一种具有抑菌或杀菌作用的细菌素（bacteriocin）。20世纪中叶，Jacob[2]建议将细菌所产生的这种代谢物统称为细菌素，并且根据其产生菌来进行不同细菌素的命名。乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)和革兰氏阴性菌具有抑制作用的蛋白或多肽，也常称其为抗菌肽[3]。由于抗生素滥用引起的抗药性也已经成为一个严重的公共健康问题[4]，人们开始热衷于研究其他可能的抗菌剂。细菌素的治疗潜力引起了人们对这一领域的关注。研究者发现lacticin3147有治疗金黄色葡萄球菌引起的牛乳房炎的效果[5]。Svetoch等发现链球菌S760产生的乳酸菌素对因感染沙门氏菌的雏鸡有很好的疗效。Christine Beecher（2009）把乳酸菌素Lactococcus lactis DPC 3147注射进乳牛乳房中，结果发现，乳牛乳房中IL-1和IL-8表达大大增加，乳酸菌素具有调动机体免疫应答的能力[6]。可见，乳酸菌素可以起到抑菌并提高机体免疫力的作用。

乳酸菌种类繁多，而各种乳酸菌产生的细菌素各不相同，目前已有40多种，其成分和抗菌谱各不相同。同时，目前对乳酸菌素的研究主要集中在食品行业，而针对畜牧业生产过程中致病菌的乳酸菌素的研究极少。因此，本研究以本实验室分离的具有高耐药的致病菌金黄色葡萄球菌作为指示菌，筛选分泌抑制致病性金黄色葡萄球菌乳酸菌素的乳酸菌。

1 材料与方法

1.1 菌株金黄色葡萄球菌由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 试剂腌渍菜汁：农家自家腌渍菜汁、市销腌渍菜汁。培养基：改良MRS液体培养基，改良MRS培养基，普通肉汤培养基，普通琼脂培养基。试剂：革兰氏染色液配套试剂盒，细菌微量生物反应管（广东环凯微生物科技有限公司）；PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）。

1.3 乳酸菌的分离、鉴定与筛选无菌生理盐水稀释收集的各类菜汁，涂布于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养48 h，然后挑取单个菌落，进行分离、纯化。然后进行菌落形态观察，革兰氏染色及显微观察，细菌的生理生化试验。

分子生物学检测：水煮法提取细菌DNA：根据已发表的相关乳酸菌16S rDNA序列及文献，选用乳杆菌种群一特异性PCR引物：5′-ATGTGTAGCGGTGAAATGCG-3′和5′-GGCGGCTGGCTCCTAAAAG-3′。预设片段大小为765 bp。PCR反应体系：0.5 μL上引物，0.5 μL下引物，10 μL2×PCR Master，1 μL模板，补足双蒸水20 μL；扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行37个循环；再72℃延伸7 min。扩增完毕后进行1%琼脂糖凝胶电泳观察。最后将PCR扩增产物送由上海生物工程股份有限公司测序，测序结果用NCBI的BLAST工具软件进行同源性检索分析。

1.4 乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌试验

1）乳酸菌上清液的制备：将所分离的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，活化后取培养液，4℃、11 000 r/min，离心20 min取上清液，备用。

2）金黄色葡萄球菌液的制备：将金黄色葡萄球菌接种于普通肉汤培养基中，37℃培养24 h，活化后将细菌浓度调至1×108cfu/mL，备用。

3）乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用：试验采用牛津杯法。用无菌L棒将金黄色葡萄球菌培养物100 uL均匀涂抹在普通琼脂培养基上，待干后放置牛津杯。将乳酸菌上清液各200 uL按顺序加入牛津杯内（注意做好标记）后，放入4℃冰箱扩散24 h，再放入37℃温箱培养16 h，观察有无抑菌环并测量其直径。

1.5 酸对金黄色葡萄球菌的抑菌作用的排除用无菌L棒将金黄色葡萄球菌培养物100 uL均匀涂抹在普通琼脂培养基上，待干后放置牛津杯。将调好pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的改良MRS液体培养基各200 uL按顺序加入牛津杯内（注意做好标记）后，放入4℃冰箱扩散24 h，再放入37℃温箱培养16 h，观察有无抑菌圈并测量其直径。

1.6 过氧化氢对金黄色葡萄球菌的抑菌作用的排除为排除过氧化氢对金黄色葡萄球菌抑制作用的影响，将乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用的菌株发酵上清液用过氧化氢酶处理，未经处理的发酵上清为对照，金黄色葡萄球菌为指示菌，用牛津杯法验证上清液的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的培养特性和革兰氏染色特性从腌渍菜汁中共分离获得90株产酸菌，分别进行培养特性、形态染色特性、生化特性和PCR鉴定。结果表明，分离菌菌落形态均为圆形，湿润，表面光滑且凸起，不透明或半透明，颜色为白色或灰白色，边缘整齐(见图1-A)。在培养液中生长物混浊，兼性厌氧。革兰氏染色，油镜观察所分离菌为革兰氏阳性菌，菌体为短杆状或球状，单个、成双、链状或成堆排列（见图1-B）。

2.2 菌株的生理生化特性分离菌进行生理生化检验,结果表明，接触酶阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐，不产生吲哚、硫化氢，不分解尿素，MR反应阳性，VP反应阳性；能发酵葡萄糖、蔗糖和乳糖产酸。

图1 乳酸菌的分离鉴及药敏试验[A：MRS培养基菌落特点；B：革兰氏染色；C：16S的PCR结果（1：乳酸菌阴性；2-5：乳酸菌阳性）；D：乳酸菌上清液抑制金黄色葡萄球菌试验]

2.3 PCR检测结果引物设计和PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1-C。在765 bp有特异的条带。综上，初步确定本次试验共分离到的90株产酸菌中有73株为乳酸菌。

2.4 基因检测和测序结果分离菌16S rDNA PCR产物送上海生物工程有限公司序列测定。测序结果在NCBI的BLAST进行同源性分析。结果显示所分离的菌株与NCBI上登记的乳杆酸菌同源性达98%以上，进一步说明所分离菌株为乳杆菌。

2.5 乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌试验牛津杯法抑菌试验结果表明，73株乳酸菌中有10株乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用（见表1和图1-D）。

表1 乳酸菌上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.6 酸排除试验结果由于乳酸菌的分泌产物中有一定量的有机酸如乙酸，有机酸对细菌的生长有重要的影响。为此，设计不同pH值来测定酸对金黄色葡萄球菌的影响试验。由表2可知，不同酸度对金黄色葡萄球菌生长均无影响，特别是酸度达2.0时，仍然不能抑制金黄色葡萄球菌生长。可见，金黄色葡萄球菌具有耐酸的作用。同时也说明乳酸菌培养液对金黄色葡萄球菌的抑制作用并非由于酸的作用。

表2 不同酸度对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.7 过氧化氢排除试验结果过氧化氢是乳酸菌的分泌产物之一，为了证实本次分离的乳酸菌是通过细菌素来抑制金黄色葡萄球菌生长，设计了本试验。结果见表3，10株分离鉴定的对金黄色葡萄球菌有抑制效果的乳酸菌上清液经过氧化氢酶处理后，其中有5株已失去了抑制作用，说明这些菌株与其分泌的过氧化氢有关，而还有5株分离菌其抑菌圈直径和原上清液的抑菌圈直径相比变化不大，说明这5株乳酸菌是通过其分泌产物如细菌素来抑制金黄色葡萄球菌的生长。

表3 过氧化氢排除试验的影响

2.8 乳酸菌的测序鉴定结果本试验将5株经酸排除和过氧化氢排除试验后仍然对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制效果的乳酸菌进行测序，经基因遗传进化树分析表明，该5株分离菌均为植物乳杆菌。

3 讨论

1）乳酸菌种类繁多，而各种乳酸菌产生的细菌素各不相同。本次试验通过从农家自制各种腌制的咸菜中分离并鉴定了73株乳酸菌，经过酸排除试验和过氧化氢试验，最终确定5株乳酸菌其主要通过细菌素来抑制金黄色葡萄球菌的生长，测序分析表明，该5株菌为植物乳杆菌。

2）每种乳酸菌至少应该能够分泌一种乳酸菌素，甚至一种乳酸菌可能产生几种乳酸菌素[7]。我国拥有丰富的乳酸菌资源库，但是如何在如此丰富复杂的乳酸菌资源库中快速有效地筛选出广谱高效的乳酸菌素高产菌株，这是面临的一个重要的难题[8]。建立高通量筛选模型是新型乳酸菌开发的重要方法之一。易华西建立了Colony-PCR高能量筛选方法，从275株乳酸菌中获得1株Class 2a抗菌肽产生菌株[9]。本次试验没能应用高能量筛选方法，所以在筛选过程耗费了大量的人力和时间，在今后的试验中应该改进试验方法，提高筛选效率。

3）乳酸菌素是由乳酸菌分泌的一种具有杀菌功能的多肽或蛋白质，它对腐败菌和致病菌都有一定的抑制作用，但是细菌素本身却被消化道中的酶降解，所以现在普遍认为乳酸菌素是一种无毒安全的食品添加剂[8]。因此，筛选广谱抗菌功能乳酸菌素是未来的趋势。本次试验分离的乳酸菌，通过酸排除和过氧化氢排除试验，基本能够确定，其抑菌物质是乳酸菌素，然而该细菌素是否具有广谱抑菌功能，将在后续试验中进一步探讨。同时，如何更好地把乳酸菌素应用于畜牧生产中也是广大畜牧工作者的一个重要的研究方向。因为，抗生素的弊端在畜牧生产中已经不断体现出来，如细菌的高度耐药、抗生素残留对人体健康的影响等。健康养殖、食品安全仍然是当前畜牧生产中的一大难题。

4）在细菌素的研究中仍存在许多问题，主要体现在：细菌素的产量较低、细菌素的抑菌谱较窄、细菌素在不同介质中的溶解性和稳定性较差。因此，在今后一段时间，乳酸菌素的研究重点是根据已知蛋白质结构设计全新的氨基酸序列，人工合成新型细菌素或对现有的细菌素进行改造,提高乳酸菌细菌素的应用潜力，利用DNA重组技术合成满足人们要求的活性多肽或蛋白质，提高乳酸菌素产量水平，拓宽乳酸菌素抑菌谱，提高乳酸菌素稳定性，提高乳酸菌素抑菌活力，探讨细菌素产生菌株的自身免疫性机制[10]。

[1]朱蓓蕾.动物性食品药物残留[M].上海:上海科学技术出版社,1994.

[2]Jacob F,Siminovitchl,Wollmane.Biosynthesis of a colicin and its mode of action[J].Ann Inst Pasteur(Paris),1952,83(3): 295-315.

[3]还连栋,贾士芳,庄增辉,等.乳链菌肽(NISIN)的杀菌作用机制[J].中国食品添加剂,1997(4):21-22.

[4]唐忠有.应用乳酸菌素与抗生素类药物预防畜禽肠道细菌性疾病的分析[J].现代畜牧兽医,2008(3):45.

[5]Clare Piper,Pat G.Casey,Colin Hill,et al.The Lantibiotic lacticin 3147 prevents systemic spread of staphylococcus aureus in a murine infection model[J].International Journal of Microbiology,2012:1-6.

[6]Christine Beecher,Mairéad Daly,Donagh P Berry,et al.Administration of a live culture of Lactococcus lactis DPC 3147 into the bovine mammary gland stimulates the local host immune response,particularly IL-1 beta and IL-8 gene expression[J].Journal of Dairy Research,2009,76:340-348.

[7]蒋志国,杜琪珍.乳酸菌素研究进展[J].中国酿造,2008(18): 1-4.

[8]牟光庆,李霞,李慧,等.广谱乳酸菌素的研究[J].食品科学, 2008,29(11):469-472.

[9]易华西.分泌广谱抗菌肽乳酸菌的筛选及高效表达的调控研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2010:1-2.

[10]陈静,张玉苍,何连芳.乳酸菌产细菌素的研究进展及其应用前景[J].安徽农业科学,2011,39(4):1925-1927.

Isolation and identification of lactic acid bacteria producing anti-Staphylococcus aureus bacteriocin

Wang Quanxi Xu Lihui Deng Hongyu Wu Xuezhen Zhuang Yubin
(College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

The study was carried out to separate the lactic acid bacteria which could produce the bacteriocin against S.aureus.In this experiment,the lactic acid bacteria were isolated from the salted and preserved vegetables with the MRS medium.Identification was done by bacterial culture characteristics,Gram stain characteristics,physiological and biochemical characterization,And the bacteria was identified by PCR.The antibacterial properties of lactic acid bacteria fermentation supernatant was studied.The results showed that 73 strains acid-producing bacteria were isolated,and were identified to Lactobacillus by morphological characteristics,biochemical characteristics and PCR.The antibacterial test showed that there were ten strains Lactobacillus which secretory products could inhibit staphylococcus aureus.Ruled out by acid and hydrogen peroxide exclusion experiments,there were still 5 strains of lactic acid bacteria which secretion can inhibit staphylococcus aureus.Therefore,in this experiment the lactic acid bacterium that isolated from the salted and preserved vegetables have the activity of anti-Staphylococcus aureus,which is mainly through the secretion of lactic acid bacteria.

Pickled vegetable juice Lactic acid bacteria lactobacillus Staphylococcus aureus antimicrobial activity

A

1003-4331（2014）06-0009-04

福建省教育厅科技项目B类（JB12054）资助。