参黄液对大鼠肢体动脉缺血治疗作用的初步研究

刘振川，孙 岩 ，何玉祥，刘 洋 ，周 华 ，王茂华，袁 海 ，金 星

近年来，下肢动脉缺血性疾病的发病率逐年上升，已经成为引起肢体坏疽甚至下肢截肢的主要原因之一，严重影响患者健康［1-2］。如何有效改善下肢血供，降低下肢缺血性疾病的截肢率，改善患者的生活质量，是血管外科目前面临的重要课题。笔者所在科室多年来将自行配制的中药药液——参黄液应用于下肢缺血性疾病的治疗，主要外用于坏疽肢端和缺血肢体的局部。本研究通过动物实验进一步观察参黄液对肢体缺血性疾病的治疗效果，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠90只［由山东大学医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(17/11)20120003］，8 周龄，体重250 ～300 g。

1.2 试药与试剂

1.2.1 参黄液的配制:将丹参、丹皮、黄檗、苦参、黄连按一定比例用75%乙醇浸泡1周后待用。

1.2.2 试剂:月桂酸(Sigma Aldrich)。生物素化二抗工作液(过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色试剂盒):山羊多抗，通用型SP Kit工作液，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，产品编号:SP-9002。血管内皮生长因子(VEGF)一抗:小鼠多抗，Santa Cruz Biotechnology公司生产，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号:SC-7269。

1.3 方法

1.3.1 造模与分组:采用日本学者Ashida等［3］的方法复制后肢缺血大鼠模型，具体方法:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3．5 ml/kg)进行麻醉，在显微镜辅助下行后肢股动脉穿刺，注入月桂酸0．2 ml(浓度10 mg/ml)。给药后大鼠后肢逐渐出现肿胀、皮色皮温改变、坏疽等表现，表明造模成功。将造模成功后的90只大鼠随机分为空白对照组(A组)、75%乙醇治疗组(B组)及参黄液治疗组(C组)，每组30只。3组一般资料比较差异无统计学意义(P ＞0．05)，具有可比性。

1.3.2 治疗方法:造模后立即开始给药处理［4］。A组不做任何处理，B组用75%乙醇浸泡造模侧后肢，早晚各1次，每次15 min;C组用参黄液浸泡造模侧后肢，早晚各1次，每次15 min。

1.4 观察指标

1.4.1 肢体缺血程度评价:造模后第21天，观察大鼠造模侧后肢的皮色、皮温、动脉搏动情况，以及患肢有无肿胀、继发感染、坏疽和木乃伊化，并将观察结果分组详细记录。肢体缺血程度评分标准［5］:肢体正常，无缺血为0分;趾端苍白或行走姿态异常为1分;出现坏疽，但坏疽范围不超过半足，且肢体其他部位无坏疽为2分;出现坏疽但坏疽范围不超过半足，且伴有肢体其他部位坏疽为3分;肢体坏疽范围超过半足为4分;坏疽范围超过膝(肘)关节为5分。

1.4.2 平均微血管密度(MVD)测定:造模后第21天处死大鼠并留取造模侧后肢肌肉标本，对所有标本进行MVD检测，CD34标记血管内皮，计数MVD采用Weidner［6］方法:在40倍光镜下扫查整个切片，寻找血管高密度区(热点)，在400倍视野下计数3个视野被染成棕色的血管数，取平均值作为MVD值。

1.4.3 血管内皮生长因子(VEGF)检测:应用免疫组化SABC法检测VEGF相关抗原的表达情况，其阳性表达为肌肉细胞内出现棕黄色颗粒［7］。利用免疫组化图像分析系统对组织切片进行图像分析，每例选5张组织切片，首先于低倍镜下找出5个着色最深的区域(热点)，再对这些区域进行数字图像处理，测出积分光密度后取平均值。

1.5 统计学方法 应用SPSS 15．0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验;等级计数资料比较采用秩和检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 肢体缺血程度比较 C组肢体缺血程度与A、B组比较明显减轻，差异有统计学意义(Z=－2．672，P=0．002;Z= －1．985，P=0．021)，A、B组间比较差异无统计学意义(Z=－0．677，P=0．239)。见表 1。

表1 3组大鼠肢体缺血程度评分结果

2.2 MVD比较 免疫组化毛细血管染色在高倍镜(400×)下观察得到 A、B、C组标本 MVD分别为(4．00 ±1．31)、(4．00 ±1．11)、(5．00 ±1．23)根。C组MVD明显高于A、B组，差异有统计学意义(t=2．135，P=0．031;t=2．067，P=0．026)，但 A、B 组间比较差异无统计学意义(t=0．002，P=5．127)。

2.3 VEGF阳性表达比较 3组造模侧后肢内收肌标本均可检测到VEGF蛋白的阳性表达，C组表达呈强阳性，B组表达较C组弱，A组几乎无表达(图1～3)。图像分析显示，A、B、C组积分光密度分别为6401．11 ±397．22、6345．96 ±406．50、6719．61 ±323．84，C组高于 A、B组，差异有统计学意义(t=2．601，P=0．022;t=2．733，P=0．021)，A、B 组间比较差异无统计学意义(t=0．001，P=8．235)。

3 讨论

近年来，随着高血压病、冠心病、高脂血症的发病率不断升高，随之由动脉粥样硬化引起的下肢缺血性疾病也逐渐增多，已成为下肢缺血性坏疽甚至截肢的主要原因之一［2］。肢端坏疽是糖尿病晚期的严重并发症，也成为下肢截肢的重要因素。在有大量吸烟史的青壮年人群中，血栓闭塞性脉管炎(TAO)是导致其截肢的最常见血管疾病［8］。此外，急性动脉栓塞若治疗不及时，亦可导致肢体坏死甚至截肢［1］。

图1 3组大鼠造模侧后肢内收肌标本血管内皮生长因子的表达(SABC法×100)

如何改善肢体缺血症状，避免肢端坏疽造成的截肢是血管外科目前面临的难点和研究热点。临床常用的治疗手段有药物治疗、手术治疗、介入治疗、基因治疗和干细胞移植等，这些方法单独或联合应用均取得了良好的效果［9-13］。但对于已发生坏疽的肢端和缺血肢体如何进行有效的局部处理，则长期被临床医生所忽视。坏疽肢端和缺血肢体的局部很容易继发感染，一旦发生会影响下一步的治疗，形成恶性循环，若处理不当很容易导致截肢。因此，对于坏疽肢端和缺血肢体的局部处理应成为肢体动脉缺血性疾病治疗中的重要环节。朱长庚［14］、王军等［15］应用中药浸泡缺血的指(趾)端，发现可以明显减少坏死范围，为后续治疗创造了有利条件。

笔者所在科室将丹参、丹皮、黄檗、苦参、黄连按一定比例用75%乙醇浸泡1周后制作成参黄液，用于浸泡肢体动脉缺血性疾病患者的坏疽肢端和缺血肢体，临床随访观察表明，该疗法不但可以促进缺血肢体侧支循环的建立，而且可以有效防止继发感染，从而降低截肢平面，并且在一定程度上缓解缺血导致的肢体疼痛。因主要为外用，该药在使用过程中几乎无任何不良反应，但目前参黄液外用对缺血肢体的治疗机制尚未见报道。

本研究通过建立大鼠后肢缺血模型，进一步证实了参黄液对缺血肢体的治疗作用，而且初步揭示了其作用机制。对组织切片的分析表明，C组MVD显著高于A、B组，提示参黄液可以有效促进缺血肢体组织中毛细血管的生成，从而建立侧支循环。

VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，通过结合特异性受体导致血管内皮细胞增殖、迁移，延长其存活时间和增加血管通透性，从而调节血管的生长，促进新生血管和淋巴管的形成［16-18］。本研究结果显示，参黄液可以有效促进大鼠缺血组织标本VEGF蛋白的表达，免疫组化分析显示，应用参黄液的C组VEGF蛋白表达为强阳性，其积分光密度也显著高于A、B组。从蛋白水平证实参黄液可以上调缺血肢体组织中VEGF蛋白的表达，从而促进患肢局部侧支循环的建立以发挥治疗作用，为揭示参黄液的作用机制提供了重要线索。

综上所述，本研究进一步证实了参黄液对肢体缺血性疾病的治疗作用，初步揭示了参黄液是通过调节VEGF蛋白的表达、促进侧支循环建立而起到治疗作用。不仅证实了参黄液是一种可以应用于临床处理坏疽肢端和缺血肢体局部的有效药物，而且为进一步阐明其作用机制提供了有力的实验证据。

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