诱导子在人参细胞培养中的应用研究进展

梁莹，张美萍，孙春玉，蒋世翠，王义，张斯童，纪东辉

(吉林农业大学，长春130118)

人参(PanaxginsengC.A.Mey)是我国古老而名贵的药用植物，人参皂苷是人参的主要有效成分，具有保护心脏、提高免疫力、抗疲劳、保护肝脏等广泛的药理作用[1]，但人参皂苷含量很低，且尚未实现人工合成，通常大田栽培获得的人参中含量仅为3%左右[2]。采用植物细胞培养手段实现人参皂苷的快速、大量积累是克服大田栽培周期长、对栽培环境要求苛刻的最有效手段。因此，应用生物学等手段进行有目的地调控人参皂苷的生物合成已受到越来越多学者们的关注。

从细胞培养的角度讲，诱导子(elicitor)是指对植物细胞目的产物产生促进作用的因子。从植物病理学的角度讲，是指在植物抗病过程中，能诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。诱导子在植物与微生物之间相互作用，能快速、专一性地诱导特定基因的表达[3]。众多研究表明，诱导子能够有效地调控植物细胞次生代谢产物的合成，并能促进其分泌到培养基中[4]。人参皂苷作为人参属植物的一种次生代谢产物，是研究植物次生代谢信号识别及其细胞内信息传递的良好实验体系。利用诱导子处理人参细胞培养物，促进次生代谢产物的合成，已成为国内、外学者们广泛重视的新方法。本文就各种诱导子对人参细胞培养生产皂苷的最新研究进展进行综述。

1 诱导子的分类

从植物的防卫反应角度不同来划分，诱导子可分为外源诱导子(exogenous elicitor)和内源诱导子(endogenous elicitor)。外源诱导子是指植物细胞细胞壁的果胶多糖类等来自植物细胞的诱导子；内源诱导子是指各种病原菌分泌的代谢物等来自植物细胞外的诱导子。从诱导子特异性方面划分，可分为特异性诱导子(specificity elicitor)和非特异性诱导子(non-specificity elicitor)。从化学组成上划分，诱导子可分为蛋白质类诱导子、多糖类诱导子、多肽类诱导子及脂类诱导子。从来源上划分，诱导子可分为生物诱导子(biotic elicitor)和非生物诱导子(abiotic elicitor)[5]。生物诱导子是指植物在防御过程中为了对抗微生物感染所产生的物质，包括各种病原菌(细菌、真菌、酵母及病毒等)、植物细胞分离物和代谢物、降解细胞壁的酶类以及培养物滤液中的成分，其中主要为细胞壁水解物；非生物诱导子是指能起到诱导作用的紫外线、辐射、冻融等物理因子和乙烯、氯仿、重金属盐类、杀真菌剂、去污剂等化学因子[6]。

本文主要从生物诱导子和非生物诱导子的角度综述不同来源的诱导子在人参皂苷合成中的应用。

2 生物诱导子在人参皂苷合成研究中的应用

2.1真菌诱导子

真菌诱导子来源于真菌，能引起植物细胞合成并能快速、专一地促进植物次生代谢产物积累。近年来，关于真菌诱导子诱导人参细胞培养物中人参皂苷积累的研究屡见报道[7]。

隋昌海等[8]以人参根际优势菌种地球囊霉作为诱导子来提高人参培养物中人参皂苷的含量发现，在人参愈伤组织生长第21天(即对数生长期晚期)加入浓度为0.10mg/mL的诱导子，皂苷含量达到3.6%，是对照组的1.63倍。

刘峻等[9]选择不同浓度的棉花枯萎病菌、黑曲霉、黄瓜碳疽病菌及青菜炭疽病菌作为诱导子，研究其对人参发状根生长及皂苷合成的影响。结果表明，浓度为40mg/L～800mg/L的棉花枯萎病菌能抑制发状根的生长及皂苷合成；20mg/L的黑曲霉能够促进总皂苷合成，是对照组的1.46倍，且浓度在20mg/L～400mg/L的范围内均可促进发状根的生长；浓度为800mg/L时，黄瓜炭疽病菌可促进总皂苷的合成，总苷含量为3.636%，是对照组的1.46倍，但此浓度抑制发状根的生长；青菜炭疽病菌在40mg/L～800mg/L的浓度范围内对发状根的生长呈抑制作用，但对总皂苷合成有促进作用。

刘长军等[10]分别用黑曲霉、尖孢镰刀菌、刺盘孢菌和茎点属菌菌丝体制备诱导子，添加于人参悬浮培养细胞中，研究不同浓度的诱导子对人参皂苷合成量的影响，结果表明，在人参细胞悬浮培养初期加入20μg/mL的黑曲霉，培养23d后收获，皂苷含量可提高到细胞干重的6.8%，是对照组的1.3倍。在人参悬浮细胞培养的第15天分别加入4种诱导子发现，各组中人参皂苷积累时间分别较对照组提前了2d～4d，缩短了培养时间，同时提高了皂苷产率。添加真菌诱导子后的培养基中，皂苷含量明显高于对照，占细胞总量的80%以上，其中用刺盘孢菌菌丝体处理后的培养基中皂苷含量达到179mg/L，是对照组的1.2倍。这说明真菌诱导子能够促进人参皂苷的外排，对人参皂苷的大规模发酵培养中产物的连续回收和节约成本十分有利。

2.2酵母提取物

酵母提取物(Yeast Extract，YE)是指酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质。YE是植物细胞培养中常用的诱导子，能诱导或促进植物次生代谢产物的形成。

周倩耘等[11]研究了YE对人参发状根中皂苷含量的影响，结果显示，在培养基中添加0.10mg/mL的YE，总皂苷含量为3.595%，是对照组的1.57倍，Rg1、Re、Rb1、Rd含量分别为0.192%、0.189%、0.231%、0.108%，分别是对照组的1.35倍、1.42倍、1.28倍和1.29倍，培养基中总皂苷含量为0.025%。这说明YE不仅能促进人参发状根中总皂苷和单体皂苷的积累，还能促进人参皂苷的外排，推测可能是由于YE中的Zn2+、Ca2+等阳离子及寡糖素影响了次生代谢产物的调控[12]。

K.MCY等[13]在人参细胞悬浮培养液中添加酵母诱导子，结果发现，经酵母诱导子诱导的新鲜细胞中能产生一种新的化合物2，5-二羟基-1，4-苯醌(2，5-dinethoxy-1，4-benzoquinone)，且在12h时达到最高水平(65.10μg/g±4.96μg/g)。

3 非生物诱导子在人参皂苷生物合成中的应用

3.1茉莉酸甲酯

茉莉酸甲酯(MeJA)是茉莉酸类植物内源激素，作为植物体内的一种生长调节物质，在次生代谢物合成中起着重要的调节作用。MeJA是一类特殊的环戊烷衍生物型植物激素，调节次生代谢产物生物合成的一系列酶促反应。

义7-6块主力含油层系为下第三系沙河街组沙三段9砂组。油藏平均埋深3 500m。砂层组厚度一般20～40m，砂体呈东南-西北向条带状展布，横向宽度在4km左右，为单一水道。义7-6块位于水道的边部。该区块油井渗透率差异较大，中心部储层条件较好的油井测井渗透率可达35×10-3μm2，边部的渗透率为（3～15）×10-3μm2，属中孔、（特）低渗储层。义7-6块沙三下储层类型类似樊142块，渗透率较樊142块低，井距较樊142块大，注水见效慢，因此根据储层特性优化井网、井距，并与压裂规模的合理匹配是直井长缝开发的关键。

王士杰等[1]研究发现，MeJA能够促进人参发状根的生长，通过向培养物中添加10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和500μmol/L的MeJA，确定了浓度在200μmol/L时诱导10d效果最好，人参发根生物量增长13.82倍，总皂苷含量达到了2.28%，比对照组高35.71%。

徐立新等[14]通过实验表明，MeJA在较低浓度的时候对总皂苷的积累和人参发根的生长有促进作用。当其浓度为0.001mmol/L时，总皂苷产量为0.120 7g/L。其中Rb1产量为11.41mg/L。升高MeJA浓度为1.000mmol/L时，Rb1产量仅为6.5mg/L。

沈旭等[15]的研究结果表明，在人参悬浮细胞培养第7天分别添加10μM、100μM、200μM、400μM的MeJA，培养11d收获，测得MeJA对人参悬浮细胞的生长有不同程度的抑制作用，并且抑制程度随着添加浓度的上升而上升，但是次生代谢产物的含量却随之而上升。进一步研究发现，第7天添加100μM的MeJA能够促进人参细胞单体皂苷含量的提高。

3.2水杨酸

水杨酸(Salicylic acid，SA)即邻羟基苯甲酸，广泛存在于高等植物体内。有研究表明，SA不仅参与植物体内的许多生理过程，还与植物抗病反应关系密切，可被看作为一种新的植物激素。

徐立新[14]等在人参毛状根培养中添加SA，探讨不同浓度的SA对人参总皂苷和单体皂苷含量的影响结果表明，SA的添加对人参发状根中总皂苷的积累无明显促进作用，且随着SA浓度的增大，对皂苷的合成显示了抑制作用，当SA浓度为0.100mmol/L时，总皂苷含量最高(0.1008g/L)；适当浓度的SA能促进Rb1的积累，当SA浓度为0.100mmol/L时，Rb1产量最高(11.49mg/L)。

张悦等[18]研究了不同浓度的SA对人参愈伤组织培养的影响。结果表明，在愈伤组织培养的第28天添加0.001mg/L的SA，培养35d后收获，皂苷含量达到3.5%，是对照组的1.3倍。实验证明了SA影响人参培养物的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活力。向愈伤组织中添加SA，作用14h后过氧化物酶(POD)的活力开始发生变化，24h酶活力最佳，是对照组的1.5倍，随后活性开始下降，72h后与对照组基本接近；添加SA 18h后，多酚氧化酶活力达到最高值，48h后人参培养物中多酚氧化酶的活力仍然高于对照；添加SA的24h内人参愈伤组织中的苯丙氨酸解氨酶的活力低于对照组，24h后迅速升高，48h活力达到最大值，是对照的1.87倍。

3.3重金属盐类

重金属盐(铜、铅、锌、铁、钴、镉等)属于无机诱导剂中的一类，能够影响、调控植物次生代谢产物合成。与其他诱导剂相比，重金属盐类来源广泛、操作简单、经济性较好[19]。

黄超等[20]研究了钒酸盐对人参细胞悬浮培养中皂苷合成的影响。在细胞培养的第4天添加50μM的钒酸盐(NH4VO3)，皂苷含量达到499.3μg/100mg DW。同时，研究了在皂苷合成中2个关键酶UGRdGT和P6H的变化情况。这2个皂苷合成关键酶的酶活性在钒酸盐加入后有显著的增加，并同时在细胞培养的第6天达到了最大值。添加诱导子作用后的第4天～第10天内，UGRdGT和P6H的酶活性都明显高于对照组。结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，分析了经钒酸盐诱导后的第6h、12h、24h和48h后的基因转录水平的实时变化情况。结果表明，经钒酸盐诱导后，4个基因的转录水平都有显著的增加。添加诱导子12h后，鲨烯合成酶(Squalene synthetase，SQS)、鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SQE)和达玛烷合成酶(Dammarenediol synthase，DS)的转录水平分别是对照组的7.6倍、10.3倍和17.8倍。12h～36h内，SQS的基因转录水平与对照组相比没有明显差异，而SQE的基因转录水平仍然显著高于对照组。在6h～48h内，环阿屯醇合成酶(Cycloartenol Synthase，CAS)的基因转录水平与对照组没有明显变化。人参皂苷合成关键基因转录水平的快速上调促进了皂苷合成。

4 展望

在适宜条件下，通过添加诱导子来提高植物细胞中有益次生代谢物的含量，特别是运用诱导子手段调控人参皂苷代谢途径，提高人参细胞培养物中人参皂苷的含量，具有良好的经济和社会效益。目前对于诱导子在人参细胞培养中的应用研究取得了一定进展，但还存在一些不够完善的地方，例如诱导子和代谢产物之间结构与功能的关系、诱导子受体的提取纯化等，这些问题导致了诱导子作用机制的不确切性，如果上述问题能有效地解决，就可用现代分子技术在分子水平上阐明人参皂苷的合成机制，为今后的诱导培养人参细胞提供可靠的理论依据。

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