大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

李兰兰　陈玲肖　马炬明

[摘要] 目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。方法 采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。 结果 获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。结论 全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04

BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 时间及地点

于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。

1.3 实验主要试剂

低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O（Cyagen公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs的原代分离培养 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，置于75%的乙醇中浸泡7 min。无菌条件下分离股骨和胫骨，眼科剪切除两端骨骺，用2.5 mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，待骨髓腔变白。充分吹打混匀，经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块。收集细胞悬液于15 mL离心管中，400 g室温离心5 min。离心后去上清，用5 mL完全培养液重悬，混匀，转移至25 cm培养瓶中，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。2 d后首次全量换液，以后每3天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。

1.4.2 BMSCs的纯化扩增 待细胞融合至80%开始传代，PBS冲洗。加入1.0 mL预热的0.25%胰酶-0.02%EDTA，轻轻摇动培养瓶，室温孵育0.5 min，待镜下胞质回缩后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，并轻轻吹打培养瓶底。将细胞悬液转移至15 mL离心管，400 g室温离心5 min，弃上清，完全培养液重悬，以1∶2或1∶3比例进行传代培养。此时细胞记为P1，以后每周换液2次，待细胞融合达80%后，重复上述步骤进行传代，依次记为P2、P3等。

1.4.3 BMSCs 的生长曲线测定 取生长良好的第3代细胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA常规消化，以2×104/mL 接种于24孔板，每天取3孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续8 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期 取生长状态良好的第3代BMSCs，常规消化，制成单细胞悬液，将200 μL 4℃预冷的乙醇与细胞悬液均匀固定，室温孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，尽量避免产生气泡，室温孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室温避光孵育15 min，上机检测。

1.4.5 流式细胞仪检测细胞表面标记 待第3代BMSCs融合至80%，常规消化制成单细胞悬液，分装至EP管中。于待检测的样本中各加入100 μL PBS重悬，分别加入CD34，CD44，CD45，CD90一抗及同型对照10 μL，充分混匀，室温避光孵育30 min后，用PBS洗涤2次，400 g，室温离心5 min，弃上清，每测试管加500 μL PBS，充分混匀，流式细胞仪检测。

1.4.6 成脂肪细胞诱导分化 待培养的P3 BMSCs生长至80%融合，常规消化，以2×105/孔密度接种于6孔培养板，每3天换新鲜的基础培养液，待细胞完全融合后，实验组加入2 mL成脂肪诱导分化培养液A，3 d后将分化诱导液换为成脂肪诱导分化培养液B，1 d后再换回成脂肪诱导分化培养液A进行诱导，如此循环3～5次后，用成脂肪诱导分化培养液B继续维持7 d，每3天进行换液，对照组加入等量基础培养液。倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，21 d后进行油红O染色。

1.4.7 成骨细胞诱导分化 待培养的P3 BMSCs生长至80%融合，常规消化，以3×104/孔密度接种于6孔培养板（培养皿底部有明胶包被），常规培养1 d后，细胞达50%～70%融合，实验组加入2 mL成骨诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3天换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。成骨诱导21 d后进行茜素红染色。endprint

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察

刚接种时细胞悬浮于培养液中，呈圆形，大小不一，折光性较强。48 h首次换液后可见大量细胞贴壁，形态不一，部分伸出伪足。三四天贴壁细胞数量增多，细胞伪足增长呈短梭形。五六天细胞增殖迅速呈克隆样生长的集落。八九天左右细胞形态基本为长梭型细胞，纵轴相互平行排列，一般可达到80%的细胞融合状态。传代细胞接种4 h后基本完全贴壁，很快铺展。细胞增殖速度较原代快，呈均匀分布的纺锤形，五六天即可传代，见图1。

图1 P3 BMSCs培养5 d，×100

2.2 BMSCs的生长曲线

接种后，BMSCs经过1～2 d的潜伏适应期后进入对数增殖期，第7天达顶点，随后进入平台期（平均细胞计数依次为2、2.22、2.44、3.33、5.67、7、8.22、8.11×104/孔），生长曲线呈S形，符合正常细胞的生长特性，见图2。

2.3 细胞生长周期

流式细胞仪检测结果显示，第3代BMSCs中G0/G1期细胞为86.02%，G2期细胞为5.41%，S期细胞为4.90%，见图3。

图3 P3 BMSCs细胞周期

2.4 BMSCs表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示，细胞CD44、CD90阳性率分别为96.2%、97.9%，CD34、CD45阳性率分别为0.3%、0.9%，验证此细胞为BMSCs，纯度较高，见图4。

2.5 诱导分化鉴定

成脂诱导后细胞逐渐由梭形变为圆形，油红O染色可见橙红色折光性强的脂滴，呈圆形，定位于胞浆，见图5A。成骨诱导后细胞外基质分泌逐渐增多，局部细胞呈重叠生长，染色后可见大量橘红色致密结节形成，见图5B。对照组均呈阴性染色。

A：实验组油红O染色；B：实验组茜素红染色

图5 多向分化功能鉴定（×100）

3 讨论

BMSCs是一种存在于骨髓间质内的非造血系成体干细胞，可以自体取材，具有多向分化潜能，无伦理学限制。目前分离方法主要包括密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分离法及免疫磁珠分离法[5]。后两种方法分离的细胞纯度较高，但价格昂贵，对细胞活性有较大影响，目前应用较少。杨丽等[6]研究发现，全骨髓贴壁法比密度梯度离心法更加简单实用，降低了离心对细胞的损害，分离的细胞贴壁时间短，增殖快。考虑离心过程中，丢失了促进BMSCs贴壁的一些生长因子及促黏附物质，改变了骨髓中原有的微环境，所用的分离液对细胞有一定的毒性作用，影响细胞的活性。林楚伟[7]等证实全骨髓贴壁加差速传代法分离培养的BMSCs生长增殖活力强于密度梯度离心法。张君红[8]等观察到使用SD雌性大鼠分离后的细胞悬液含有较多脂滴，贴壁细胞不牢固且传代困难，可能与雌、雄性大鼠体内的雌、雄激素等水平存在差异有关。

全骨髓贴壁法是利用BMSCs对塑料底的贴附性，定期换液去除悬浮生长的造血系细胞，进行分选纯化。利用BMSCs较巨噬细胞、单核细胞等易于消化的特点，严格掌握消化酶的量及消化时间，发现细胞间隙增大后，应立即消化，轻柔吹打，尽量避免出现气泡。注意传代时的细胞融合程度，避免细胞接触抑制，延缓细胞老化的时间。BMSCs生长时密度依赖性极强[9]，注意传代细胞的种植密度。首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境。

多数学者认为采用形态学观察、增殖能力、表面标志及多向分化的特点进行逆向推断是否为BMSCs[10]。大量的研究表明BMSCs表达CD29、CD44、CD71、CD73、CD90和CD105等表面标志，不表达造血细胞的表面标志如CD14、CD34、CD45、CD106等[11]。本方法所培养细胞为贴壁生长细胞，呈长梭形、纺锤形等成纤维细胞形态，大小比较均一，呈“漩涡状”生长。细胞生长曲线呈S形，经历潜伏适应期、对数增殖期、平台期，符合正常细胞的生长特性。流式细胞仪检测结果提示大多数BMSCs处于静止期，保持自我更新和增殖潜能，约10%处于功能期，具有强大的分化增殖能力。高表达细胞表面抗原CD44、CD90，低表达CD34、CD45，能向成骨、成脂分化，具有多向分化潜能，符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源BMSCs的三条最低标准，为下一步探讨BMSCs逆转肝纤维化的机制提供功能稳定的种子细胞。

尽管对间充质干细胞的研究已很深入，但其缺乏特异性表型标志物，如何准确简便地鉴定BMSCs以及其体外分化诱导机制尚不清楚，还有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Chamberlain G，Fox J，Ashton B，et al. Concise Review：Mesenchymal stem cells their phenotype，differentiation capacity immunological features and potential for homing[J].Stem Cells，2007，25（11）：2739-2749.

[2] Lysy PA，Campard D，Smets F，et al. Persistence of a chimerical phenotype after hepatocyte differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Cell Prolif，2008， 41（1）：36-58.

[3] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science，1999，284（5411）：143-147.endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 杨丽，张荣华，谢厚杰，等. 建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚伟，周胜华，杜优优. 全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 张君红，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 杨丽，张荣华，谢厚杰，等. 建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚伟，周胜华，杜优优. 全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 张君红，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 杨丽，张荣华，谢厚杰，等. 建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚伟，周胜华，杜优优. 全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 张君红，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint