水貂阿留申病分子生物学及防控技术研究进展

王振军，吴威，闫喜军，呼延良浩，纪银铃，侯海良，张蕾※，李明霞

(1．中国农业科学院特产研究所，长春130112；2．吉林省集安市种子公司，吉林集安134200；3．安华农业保险股份有限公司吉林省分公司，长春130122；4．吉林省白山市畜牧总站，吉林白山134300)

水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，ADV)引起的，被称为毛皮动物三大疫病之一。该病可以严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，给养貂业带来巨大的经济损失[1]。水貂阿留申病的发病和预后受到水貂基因型、年龄、毒株种类等多种因素的影响，典型的病理及临床症状主要有以下两方面：对于新生幼貂来说，由于体内抗体水平低且自身免疫系统尚未发育完善，ADV可以引发新生幼貂的急性间质性肺炎，死亡率很高；另一方面，对于成年貂则多是以慢性、持续性感染为主，以浆细胞增多、高免疫球蛋白血症、免疫复合物介导的肾小球肾炎和动脉炎为特点，有的病貂还有非化脓性脑膜炎的症状[2，3]，临床上可见病貂渐进性消瘦、口渴、贪饮等症状，母貂除上述症状外可见产仔量下降、死胎、流产数量增多[4]；剖检可见肾脏肿大发白，脾脏有陈旧的坏死斑等。病貂可通过粪便、唾液长期向外界排毒，养殖场工作人员不规范的操作也起到了被动传播ADV的作用，所以AD在国内水貂养殖场的流行是十分普遍的。由于ADV的感染呈现抗体依赖性增强(ADE)的现象，至今仍无有效的疫苗研发思路，国内、外学者现多在AD诊断方面开展研究，以期用更加精准的检测方法淘汰阿留申病貂。

1 水貂阿留申病的分子生物学研究进展

1.1 ADV的基因组结构

国际病毒分类委员会(ICTV)第八次会议将ADV归类为细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)阿留申病毒属(Amdovirus)[5]。ADV是单股负链DNA病毒，基因组全长约4.8Kb，3′端和5′端均含有200bp左右的末端回文序列并形成发夹结构，3′端的发夹结构较短，5′端的发夹结构较长，它的主要功能是作为病毒的复制起始点和包装信号[6]。目前，国内、外已经分离出多种ADV毒株，如高致病性的ADV-Utah、ADV-K、ADV-United等；低致病性的ADV-Pullman等；以及对水貂无致病力的ADV-G株，它是ADV-Utah株在体外细胞传代培养后失去致病力的实验株，只能造成体外培养的Vero、CRFK等细胞感染，而并不引起水貂发病[7]。到目前为止，在世界范围内还没有任何官方报道的关于ADV的基因型，根据世界各水貂养殖国家的流行病学调查，各地都有不同的ADV毒株，甚至同一个地区同一个养殖场都有不同的毒株存在。现今只有ADV-G株病毒完成了全基因组序列的测序工作[6]，本文以ADV-G株病毒序列为例对其进行结构和功能方面的简要说明。

Alexandersen等[8]早在1988年就对ADV的转录进行了研究，证实了ADV的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)主要包括5个：左开放阅读框(LORF)约长1 859nt，右开放阅读框(RORF)约长2 105nt和3个较短的中间开放阅读框(mid-ORFs)，此外，还有启动子序列(TATA box)和polyA位点。整段序列含有2个启动子P3、P36，由这2个启动子分别启动转录，转录后经过mRNA的可变剪接合成R1、R2、R2′、R3、RX 5种mRNA，最终翻译成ADV的各种蛋白。

1.2 ADV基因的复制和表达

ADV属细小病毒科成员，它的复制和转录是在宿主细胞核内进行的，基因组DNA的复制所需要的DNA聚合酶及辅助因子都依赖于宿主细胞，而且要求宿主细胞处于有丝分裂的S期，此时的宿主细胞中DNA聚合酶的活性旺盛。当被感染的细胞进入有丝分裂S期时，ADV便利用细胞核内高活性的DNA聚合酶进行自身基因组的合成，以此来完成自身基因组DNA的复制[9]。ADV在复制方式上与其他细小病毒类似，即先以3′端发夹结构提供的3′-OH为引物，在DNA聚合酶的作用下合成复制型中间体，再由复制型中间体形成子代病毒基因组[10]。在ADV的基因组DNA复制的过程中，ADV的NS1蛋白起到了关键作用，它的作用包括在特异性位点切断DNA、ATP酶作用和解旋酶作用[11]。

ADV基因表达的蛋白包括结构蛋白和非结构蛋白。结构蛋白包括VP1、VP2 2种，是由位于基因组右侧的ORF负责编码的。编码VP1蛋白的基因(2 043nt)包含了编码VP2蛋白基因(1 917nt)的全部序列，只是在其5′端较编码VP2蛋白的基因多出126个碱基，对应的在表达的VP1蛋白的N端比VP2蛋白多出了42个氨基酸残基；非结构蛋白包括NS1、NS2和NS3，是由位于基因组左侧的ORF编码的，其中NS1是最大的非结构蛋白，它是经过转录剪接后形成的1 962nt的序列翻译出的，大小约为72Ku[8，12]。ADV基因的表达调控主要在基因的复制、转录、转录后和翻译4个环节。其中复制和转录环节是发生在宿主细胞核内的，主要行使调控功能的是NS蛋白和ADV基因组自身的调控单元、末端发夹结构、启动子区、polyA等，这些调节蛋白和调控基因共同构成了ADV基因组表达调节系统[13]。Christensen等[14]在用昆虫杆状病毒表达体系表达ADV蛋白时，通过免疫荧光试验证实了ADV的VP1蛋白、VP2蛋白、NS1蛋白在昆虫细胞的细胞核周围表达，NS2蛋白在细胞质中表达，所以ADV基因在转录后和翻译环节也可能发生在对应的区域。

1.3 ADV蛋白的功能

1.3.1非结构蛋白在ADV的非结构蛋白中，研究最多的是NS1蛋白，它是病毒在侵染宿主细胞和复制时发挥功能的一种多功能蛋白，尤其在基因组DNA复制和启动子调节方面发挥重要作用，分子量约为71Ku。Christensen等[14]曾用昆虫杆状病毒表达系统成功表达NS1蛋白，获得了大量有活性的纯化蛋白，此外，Christensen等[15]还认为，NS1蛋白存在细胞抑制作用或细胞毒作用，因其发现NS1蛋白在昆虫细胞中表达的时候引起了细胞形态学的变化，在转染期间重组的杆状病毒滴度下降了10倍。对于ADV-NS2蛋白的研究目前尚缺乏充足的资料，但有学者认为其在ADV基因组复制方面起作用[16]。而ADV-NS3蛋白存在与否还没有确切的说法，国内、外学者对其研究较少。Christensen等[14]曾用实验证实，NS3蛋白在昆虫细胞中表达时呈弥散式分布，分子量约为10Ku，但对其功能没有详述。

1.3.2结构蛋白ADV的结构蛋白VP1和VP2共同组成了ADV的蛋白衣壳，大小分别约85Ku和75Ku，但是两者的比例却相差很大，VP2占约90%，VP1只占约10%[17]。可见ADV-VP2蛋白占了病毒的绝大部分，所以可以推断VP2蛋白上存在ADV主要抗原表位，对此国内、外学者针对VP2蛋白进行了体外表达，并且用多种方法验证了其抗原性良好。Christensen等[14]用昆虫杆状病毒表达系统表达2种结构蛋白，并通过免疫荧光证实其在昆虫细胞的细胞核周围进行表达，而且在电子显微镜下观察到表达蛋白和ADV-G株病毒的衣壳蛋白很相似，难于区分；Bloom等[18](1994)用重组的核型多角体病毒表达了ADV的结构蛋白，并通过CIEP方法证实其抗原性比商业抗原更敏感；Anna Knuuttila等[19](2009)用昆虫杆状病毒表达系统表达ADV的VP2蛋白并建立了ELISA方法诊断AD，据报道，该诊断方法的敏感性和特异性分别达到了99%和97%；梁冬莹[20](2007)采用原核表达系统分段表达ADV结构蛋白基因，经过CIEP验证重组蛋白在诊断试验中重复性、敏感性和特异性均较好，这些研究均证实ADV的VP2蛋白有很好的反应原性。

2 水貂阿留申病诊断方法的研究进展

自1956年发现AD以来，各国学者都在寻找一种能够防治该病的方法，因ADV病毒感染后会呈现抗体依赖性增强的现象[21]，所以很难通过研制有效的疫苗来控制预防该病，因此各国学者在ADV的检测手段上不断创新，通过定期对ADV病貂的筛查、淘汰病貂来净化貂场，进而达到防控该病的目的。ADV的检测方法有多种，主要有病原学、血清学和分子生物学诊断，以下将分别予以介绍。

2.1 病原学诊断

这种诊断方法有赖于电子显微镜技术。对感染病貂的脏器(肝脏、脾脏、肾脏或淋巴结)进行研磨并超速离心后，用除菌膜过滤上清液，进行负染后在电子显微镜下可直接观察病毒粒子，病毒粒子直径22nm～25nm，呈正20面体[22]。这种检测方法周期长，且不容易与其他细小病毒区分，一般只用于辅助检测，不适合临床检测。

2.2 血清学诊断

血清学诊断是应用最为广泛的诊断方法，具体的检测方法主要有以下几种：碘凝集试验(IAT)、对流免疫电泳(CIEP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光、免疫复合物(CIC)检测等。

2.2.1碘凝集试验Henson等[23]于1962年率先将IAT应用于水貂阿留申病的检测，IAT的检测原理是：ADV感染后血液内的丙种球蛋白增多，当丙种球蛋白增加到一定浓度后会和碘发生凝集反应。但是这种检测方法是非特异性的，所有能够引起丙种球蛋白增多的疾病都可以发生碘凝集反应，比如结核、肝肾等疾病均可呈现IAT阳性反应[24]。而且在ADV感染的初期，血液中的丙种球蛋白并没有明显地升高，到感染后的3周～4周才出现较高水平的丙种球蛋白，所以IAT无法检测ADV感染初期的水貂，也就错失了从根本上扑灭该病的机会，这样IAT在ADV的筛查上存在很高的假阴性和假阳性率，因此这种方法被应用多年但始终没能达到扑灭该病的目的。

2.2.2对流免疫电泳(CIEP) 1972年由Cho等[25]在加拿大应用CIEP诊断水貂阿留申病，这是在世界上首次将这种方法用于检测水貂阿留申病，我国从20世纪80年代起开始应用CIEP来检测阿留申病，直到现在这种方法是国内、外公认的检测ADV的黄金法则。CIEP的原理是：抗原抗体在电场的作用下和ADV相向运动，当两者相遇之后会在琼脂凝胶板中形成清晰的沉淀线。研究显示，水貂在感染ADV后9d～11d就可以产生沉淀抗体，并能够稳定地维持6个月以上，这种方法无论在特异性还是敏感性、重复性上都远远高于IAT法，很快在世界各水貂养殖国家应用，并一直沿用至今[26]。我国在20世纪80年代由中国农业科学院特产研究所研制的水貂阿留申病CIEP抗原获得批准，并成功商业化，广泛应用于海关以及国内水貂养殖单位。目前国外也有用CIEP法并辅助PCR法来共同检测AD的报道[27]。

2.2.3酶联免疫吸附试验早在1982年，国外学者Wright等[28]尝试了用ELISA方法检测ADV，并对这种方法的检测结果做出了评价，但由于当时该方法存在很高的假阴性率，所以不是一种有效地检测AD的方法。吴威等[29]用感染水貂ADV-G株病毒的猫肾细胞CRFK建立了检测水貂阿留申病病毒抗体的PPA—ELISA方法，这种方法的敏感性较CIEP高，有快速准确的优点。随着对ADV结构蛋白的深入研究和分子生物学技术的发展，现在国内、外已经有报道用分子生物学的手段将ADV的VP2基因克隆到表达载体上，然后在特定的表达系统中批量表达VP2蛋白，再用表达的VP2蛋白作为包被抗原，进而建立一种更加快速灵敏地检测AD的ELISA方法。如Anna Knuuttila等用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了VP2蛋白；梁冬莹等用原核表达系统成功地表达了VP2蛋白，而且以上方法表达的蛋白经过验证其敏感性和特异性均较高，但是用这些方法表达出的蛋白未经纯化，其中含有大量的细胞成分，若对该抗原进行纯化，其特异性和敏感性会更高。

2.2.4间接免疫荧光试验Porter等[30]在1969年用这种方法检测AD，该法需要利用细胞培养技术对培养细胞进行同步接毒，在细胞出现病变后，再用待检血清中和病毒，最后用荧光二抗反应后在荧光显微镜下观察荧光现象。虽然这种方法在诊断方面很特异，但由于这种方法周期长、步骤繁琐、重复性差等缺点不适合应用于临床诊断。

2.2.5循环免疫复合物检测(CIC) ADV感染水貂后在体内形成抗原抗体复合物，由于AD主要是由免疫复合物引起的疾病，所以检测水貂体内CIC含量也可以作为一种诊断依据。1997年，赵元楷等[31]建立了应用聚乙二醇(PEG)沉淀比浊法检测阿留申病貂血清中CIC的新方法并获得应用。也有学者建议在貂场选种时，同时应用CIEP法和CIC检测法，挑选免疫复合物OD值低的留作种用[23]。

2.3 分子生物学诊断

2.3.1聚合酶链式反应(PCR) 自20世纪80年代PCR技术发明以来，在分子生物学领域得到普遍应用，它利用高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤循环往复，可以使待扩增的DNA片段在数小时内复制上百万倍，从而实现了基因的体外扩增。PCR技术被广泛应用在疾病检测方面。根据GenBank上公布的ADV序列，用引物设计软件设计出针对ADV的特异性引物，用这种特异性引物进行PCR检测，可以十分敏感、特异地检测出待检物中是否有ADV，其准确性和特异性要高于CIEP。国外早已有关于用PCR方法检测水貂阿留申病的报道，但国内目前对AD的检测还是依赖于CIEP。Jensen等[32]研究证实了PCR检测ADV的敏感性要高于CIEP。2012年在丹麦举行的国际科学大会毛皮动物产业分会上，有关于用PCR方法防控ADV的报道，A.Cepica等[27]指出，从20世纪70年代中期加拿大等国就开始用CIEP法防控水貂阿留申病，经过近40年的努力，水貂阿留申病得到了有效地控制，但还是有小范围的流行，因为病毒在感染水貂开始时隐藏在感染水貂体内，这时很难用血清学手段检测出来，这样就造成漏检，漏检的假阴性水貂在过了病毒的潜伏期后就会表现出症状。隐藏在环境中的病毒，随时可能潜伏到动物体内并对动物造成感染，所以他认为用CIEP和PCR 2种方法来共同监测AD是更为有效的方法。

此外，国外还有用核酸杂交技术对貂群进行阿留申病的普检的报告，如Haas L等[33]就用Southern blot方法分析了从感染水貂的脾脏、肾脏、淋巴结、骨髓等脏器中提取的DNA样品，结果显示只在脾脏和骨髓中检测到了病毒DNA的复制。目前国外在这方面研究较多，国内没有这方面研究的报道。

综上所述，CIEP法仍是目前应用最多、最广泛的检测AD的方法，这种方法要求的检测设备相对简单，便于操作，易于推广，而且检测成本较低。随着对ADV-VP2蛋白的研究的深入和分子生物学技术的发展，各国学者探索了多种针对VP2蛋白的体外表达的方法并开始应用表达抗原研究新的AD诊断方法，比如ELISA、胶体金等，这些检测方法将是未来AD诊断防控的新趋势。但在新的检测手段尚未成熟之前，CIEP还是检测AD的主要方法。

3 阿留申病的防制

国外在AD的控制和扑灭措施上做法比较彻底，比如在丹麦，法律规定每个农场每年都要上交AD检测报告，用于引种的水貂必须在引种前检测AD阴性，而一个貂场经CIEP检测有3个以上的水貂呈血清学阳性或即使仅在1只水貂体内检测到了ADV，这个农场则被视为ADV感染的农场[34]，而对被认定为ADV感染农场的水貂则要全群扑杀。但国内由于特殊的养殖模式，AD在貂场的流行很普遍，目前还做不到全群扑杀，只能通过筛查逐步淘汰ADV阳性貂。AD现在没有特异性的预防和治疗方法，因此防制该病主要依赖针对传染病的综合防制措施。

3.1 最重要的在于饲养管理

给予水貂新鲜、优质、全价的饲料，以提高机体免疫力，降低发病率。

3.2 严格遵守养殖场兽医卫生制度

对笼舍等用具定期进行火焰消毒，粪便及时清理并作无害化处理，地面、笼舍要坚持用消毒液消毒，这是防止该病传播和流行的有效办法。

3.3 建立定期检疫淘汰制度

建议貂场在每年的打皮期和配种期前进行CIEP的筛查，淘汰阳性貂，这样可以将貂场的感染貂控制在较低的范围内。

3.4 建立完善的引种检疫工作

对引进种貂要进行严格的检疫，不但要求CIEP检测阴性，有条件的要进行PCR检测，这样可以保证引进种貂无ADV感染。

3.5 抗病貂新品种的培育

通过杂交育种的办法培育抗AD的水貂新品种，此法周期较长，但能从根本上阻断AD。

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