血管内皮细胞衰老的研究进展

周智辉 综述，戴亚蕾 审校

(同济大学免疫学教研室，上海 200092)

细胞衰老可分为应激性衰老和复制性衰老［1］，应激性衰老通常是指促衰老因素刺激细胞，进而引起增殖分化异常而发生的细胞衰老;复制性衰老是指细胞在多次增殖分裂之后端粒缩短或活性下降，导致细胞衰老的发生。血管内皮细胞衰老可预期血管衰老，血管内皮细胞生物学改变是血管衰老和血管性疾病发生的基础，本研究就近期血管内皮细胞衰老的相关研究进展从促进和抑制两方面因素进行综述。

衰老(aging，senescence)，是指时间依赖的功能下降进而影响机体存活的现象，是不可逆的生命过程。细胞衰老概念的正式提出源自于1961年Hayflick［2］首次报道了体外培养的人成纤维细胞具有增殖分裂的界限，其研究结果显示体外培养的人二倍体细胞以1∶2的比率连续传代，平均只能传代40～60次，提示细胞的增殖能力以及寿命是有限的;来自胎儿肺组织的胚胎成纤维细胞平均可传代48次，而来自成年肺组织的成纤维细胞平均只能培养20代，表明细胞的增殖能力与供体年龄相关，细胞的衰老进而控制细胞的分裂次数。所有细胞衰老的共同特征［3］主要表现为:β-半乳糖苷酶的活性增高，溶酶体活性增高，蛋白质合成和降解能力下降;而内皮细胞衰老时thymosin-β-10的表达下降。关于衰老发生的机制除端粒以及端粒酶学说之外，还有线粒体功能紊乱、细胞增殖和凋亡学说、基因学说以及蛋白质修饰学说等。目前鉴定细胞衰老的常用方法是检测β-半乳糖苷酶的活性，即细胞衰老β-半乳糖苷酶染色增强，而细胞增殖能力测定、细胞周期分析、衰老相关基因表达、端粒长度以及端粒酶活性分析等也用于检测细胞衰老的指标。

1 促进血管内皮细胞衰老的主要因素

1.1 端粒与端粒酶变化

端粒是正常染色体末端包括DNA与蛋白质的复合结构，在细胞的复制性衰老中起关键作用，端粒会随着细胞分裂次数的增加而缩短，端粒DNA的丢失存在补偿机制，包括端粒酶依赖途径和非端粒酶依赖途径，端粒酶是一种特殊的RNA-蛋白质复合物，主要功能是维持端粒的长度并从头合成端粒重复序列。当端粒缩短到一定程度时，染色体末端暴露，会诱发一种类似于DNA损伤的级联信号。许多研究证实，端粒的长度与衰老密切相关，体外连续培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，结果显示随着传代次数的增加，细胞的端粒长度随之减少［4］。增龄对血管内皮细胞衰老具有重要的影响，可导致血管内皮细胞功能紊乱。李东霞等［5］通过选择青年组(3月龄)、成年组(9月龄)、中年组(15月龄)的健康雄性大鼠，通过检测血浆和主动脉组织中血管内皮功能相关指标(如 NO、eNOS、iNOS、ET-1)来评估增龄对大鼠血管内皮细胞的影响，结果显示血浆中NO、eNOS、iNOS及主动脉组织的NOS活性随月龄增加逐渐降低。分离不同月龄的小鼠主动脉内皮细胞进行培养，模拟复制性衰老模型，采用衰老相关β半乳糖苷酶染色进行跟踪，结果发现50周龄小鼠主动脉内皮细胞衰老数量明显比2周龄小鼠增多，进一步采用免疫荧光检测发现衰老细胞表面β4整合素的相对密度显著升高［4］，表明增龄会加速小鼠主动脉内皮细胞衰老。细胞在体外培养传代多次后也会出现衰老的表型，通常将此种细胞衰老称为复制性衰老，复制性细胞衰老实验中通常采用计算细胞的群倍加数(population doubling，PD)以及群体倍增水平(population doubling level，PDL)来评价细胞衰老状况。复制性衰老细胞模型的建立为探索血管内皮细胞的衰老机制提供了可靠的实验工具，众多研究通过建立血管内皮细胞复制性衰老模型，揭示了细胞衰老的分子机制以及衰老干预的最新进展［5-7］，目前大量研究结果显示不论是体内试验还是体外实验均提示增龄能够促进血管内皮细胞的衰老。

1.2 线粒体功能紊乱

自由基氧化损伤导致线粒体功能紊乱是细胞衰老的一个重要机制，线粒体是产生自由基的主要场所，也容易受到活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的攻击而产生DNA氧化损伤。一方面，氧化损伤随增龄不断累积，另一方面，机体对损伤产生应答能力。当应答反应以及损伤修复能力下降时，会导致细胞衰老，随着细胞的衰老，呼吸链的效应也随之下降，进而使ATP的生成减少［13］。常见的自由基包括氧自由基，又称活性氧，如过氧化氢等，还有羟自由基、有机过氧基和过氧化物以及氮氧自由基。自由基的产生可分为内源性和外源性，其主要特点是活性高，不稳定，易与其他物质发生反应形成新的自由基或氧化物，并且容易产生连锁反应。自由基可导致DNA特别是线粒体DNA的损伤断裂，并能促使胶原蛋白交联，导致结缔组织的理化性状发生改变。机体衰老的过程中自由基的水平会升高，而自由基对组织的损伤特别是线粒体DNA的破坏能够加速衰老，这种效应的长期累积可认为是细胞衰老发生的一个基础［14-15］。为研究ROS对血管内皮细胞miRNAs(microRNAs)表达的影响，经体外培养HUVEC，在200 μmol/L的过氧化氢刺激24 h后检测了250个 miRNAs的表达，其中 miR-200c表达显著上调，而miR-1和miR-147表达明显下调，其他的miRNAs未见明显变化［16］，进一步研究发现miR-200c可调节HUVEC细胞的增殖、凋亡和衰老;氧化应激通过miR-200c下调ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)蛋白的表达，进而显著影响细胞的增殖、促使凋亡的发生，ZEB1的下调，同样能显著促进HUVEC细胞的衰老，衰老相关β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例明显上升，P21的表达增高;过氧化氢介导的miR-200c上调的机制主要涉及p53和Rb(retinoblastoma)蛋白的参与。过氧化氢刺激不仅对HUVEC细胞有影响，也促进主动脉血管内皮细胞衰老。有研究发现100 μmol/L的过氧化氢与小鼠主动脉内皮细胞共孵育1 h后，再更换正常培养液继续培养72 h可检测到衰老细胞的比例显著上升［7］。由此可见，自由基以及氧化应激反应与血管内皮细胞衰老具有密切的关系。

1.3 细胞凋亡

细胞凋亡与细胞衰老之间存在着密切关系，细胞凋亡可通过破坏不可替代的细胞进而促进衰老。一些促凋亡因子也能引起细胞衰老，如肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNFα)，体内多种细胞，如单核/巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞等均可产生和释放TNFα，TNFα与其相对应的受体结合发挥生物学活性。近期研究［11］显示用 10 ng/ml的 TNFα 诱导 HUVEC 24 h后换液正常培养，当PD为22时，细胞开始衰老，在PD 42时细胞的生存能力显著下降，通过β半乳糖苷酶染色鉴定发现，TNFα能诱导HUVEC细胞衰老，并使抗衰老基因Klotho表达下调，缩短的端粒细胞比例显著升高。TNFα诱导的HUVEC细胞衰老主要发生在 PD 2～PD 26，而对 PD 42的HUVEC细胞诱发衰老不明显，表明TNFα可诱导年轻的HUVEC细胞衰老，而对年老的HUVEC细胞作用并不明显。没有受TNFα刺激的HUVEC细胞，随着PD的增加，ROS活性增加以及低线粒体膜电位细胞比例也随之增加，但TNFα刺激年轻(PD 2和PD 26)的HUVEC细胞后，ROS活性增加以及低线粒体膜电位细胞比例增加较未受TNFα刺激更为显著。此现象说明HUVEC的衰老不仅发生于细胞多次复制后引起的自然复制性衰老，而且还可被TNFα诱发促进细胞衰老。

2 抑制血管内皮细胞衰老的主要因素

抗衰老基因在衰老和抗衰老的平衡过程中具有重要的调控作用，现已发现与血管内皮细胞衰老密切相关的基因主要有sirtuins、Klotho、胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1，IGF-1)、FoxOs转录因子等。

sirtuins基因家族包括SIRT1-7个成员，各成员在细胞定位以及组织分布中有所区别，根据核苷酸序列将其分为 4类:Ⅰ类(SIRT1-3)、Ⅱ类(SIRT4)、Ⅲ类(SIRT5)、Ⅳ类(SIRT6-7)［17］。过表达或激活SIRT1可通过增加NO的合成从而提高血管内皮细胞的功能，为研究内源性SIRT1对内皮依赖的血管舒张以及炎症激活的作用，Stein等［18］对20 周龄 ApoE‐/‐SIRT1+/+和 ApoE‐/‐SIRT1+/-小鼠主动脉的内皮依赖功能和炎症产生途径进行了评估，较为有趣的是两组小鼠在主动脉内皮的收缩和舒张功能上未见显著差异，主动脉环的总eNOS蛋白水平以及eNOS(Ser1177)磷酸化水平也具有相似性，表明内源性SIRT1不影响ApoE‐/‐小鼠的内皮功能;然而ICAM-1和VCAM-1黏附分子表达在ApoE‐/‐SIRT1+/+小鼠主动脉硬化斑块区域明显高于ApoE‐/‐SIRT1+/-小鼠。体外实验显示血管内皮细胞经siRNA沉默SIRT1基因后，TNFα刺激5 h可显著上调黏附分子VCAM-1 mRNA的表达［18］，提示VCAM-1的上调与炎症反应密切相关，而NF-κB信号通路在炎症进程中具有重要作用，而SIRT1可通过对NF-κB亚单位RelA/p65的去乙酰化作用抑制NF-κB活化［19］。近期研究显示30个月龄小鼠主动脉SIRT1蛋白的表达量较5～7个月龄小鼠显著降低，临床数据也显示老龄健康人群组(平均64岁)肱动脉的SIRT1蛋白的表达量明显低于年轻健康人群组(平均25岁)，提示SIRT1可作为衰老及年龄相关心血管疾病的治疗靶点［15］。

Klotho基因也与血管内皮细胞的衰老密切相关，外源性Klotho可抑制ROS活性以及TNFα所引起的HUVEC细胞凋亡，也可抑制端粒的缩短及细胞衰老β半乳糖胺酶活性［11］。Klotho蛋白通过丝裂原活化蛋白激酶途径减少HUVEC细胞凋亡和衰老［21］。TNFα 可诱导 HUVEC 高表达黏附分子ICAM-1和VCAM，而Klotho蛋白能显著抑制此效应。体外实验发现TNFα能显著增加HUVEC内NF-κB的活性，而Klotho能够有效地抑制TNFα引起的NF-κB的激活，而Klotho本身并不引起NF-κB的活化;黏附分子ICAM-1和VCAM的表达通常受转录因子 NF-κB 的调节［22］，表明 Klotho蛋白是通过抑制NF-κB的活性进而抑制HUVEC细胞表达ICAM-1和VCAM达到抗衰老作用。

IGF-1在血浆中有较高含量，可由多种细胞表达分泌，对细胞的生长、增殖以及分化起重要作用。NO在内皮细胞功能维持方面发挥重要作用，主要由于其对氧化还原反应高度敏感，并具有高效的血管舒张效应，IGF-1可通过调节NO产生从而提高血管内皮的舒张功能，减少内皮细胞功能紊乱，延缓由内皮细胞功能紊乱引起的细胞衰老［23］。经100 ng/mL的IGF-1预处理人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，hAECs)24 h，再用100 μmol/L的过氧化氢诱导1 h，结果显示IGF-1能抑制过氧化氢所诱发的hAECs细胞衰老;谷胱甘肽过氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)是细胞抗氧化系统的重要组分，有研究发现IGF-1可上调GPX-1在hAECs细胞的表达及其活化，这主要是通过磷酸肌醇 3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3k)依赖的信号通路调节机制而实现［24］。

FoxOs基因有4个家族成员:FoxO1(FKHR)、FoxO3(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6。FoxOs基因在促进长寿方面具有重要作用［25］，其中FoxO1在细胞生长以及抵御氧化应激等方面已得到广泛证实。高血糖能引起人微血管内皮细胞的衰老，衰老过程中SIRT(1-7)mRNA表达均较衰老前明显下降，为进一步研究其作用机制，以FoxO1作为研究的关键分子，因为FoxO1是SIRT1的一个下游靶基因，结果发现在高血糖引起的人微血管内皮细胞衰老过程中，FoxO1的DNA结合能力下降以及乙酰化的FoxO1表达增高，但此现象可被SIRT1激动剂有效逆转［26］。抑制FoxO1的表达会降低其 DNA结合能力进而导致ROS的增高以及血管内皮细胞衰老，采用siRNA技术沉默SIRT1表达也会导致血管内皮细胞衰老，表明FoxO1在血管内皮细胞的衰老中具有重要的调节作用。FoxOs基因表达还受PI3KAkt信号通路调节，对于细胞的增殖以及细胞存活等方面具有重要的调控作用［27］。

3 结 语

血管内皮细胞的衰老是导致许多心脑血管疾病的重要原因，而目前心脑血管的疾病负担尤为突出，如何防治首先需要对发病机制进行深入的研究。除自由基、端粒、抗衰老基因、线粒体损伤、DNA损伤、蛋白质修饰以及热量限制等学说之外，炎症与衰老也存在着密切的关系，如细胞因子信号转导负调控蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)在个体生长发育过程中具有重要作用，参与抗凋亡过程。本课题组已成功建立体外高表达SOCS3的细胞模型［28］，为进一步研究SOCS3在抗凋亡过程中的分子作用机制提供研究手段。目前已证实IL-10可调控氧化性低密度脂蛋白所诱导的HUVEC细胞凋亡，其作用途径是通过上调SOCS3进而抑制p38 MAPK信号转导通路［29］。综合各学说，从网络调节角度来阐释血管内皮细胞衰老机制，血管内皮细胞的增殖和分化需要保持一个动态平衡，当促衰老因素或抗衰老因素失衡时，均可导致血管内皮细胞的衰老。促衰老因素不仅与自由基、增龄、肿瘤坏死因子等因素有关，还与抗衰老因素，尤其是抗衰老基因的作用密切相关。植物活性成分如白藜芦醇、大黄酸及其衍生物赖氨大黄酸，某些抗高血压以及糖尿病的治疗药物也具有保护血管内皮细胞的功能。这些都为血管内皮细胞衰老的机制研究提供理论数据，有望发现新的治疗靶点，为药物研发提供新的依据。

［1］ Blanco FJ，Bernabéu C.The splicing factor SRSF1 as a marker for endothelial senescence［J］.Front Physiol，2012，3(54):1-6.

［2］ Hayflick L.The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains［J］.Exp Cell Res，1965，37:614-636.

［3］ Krtolica A，Campisi J.Cancer and aging:a model for the cancer promoting effects of the aging stroma［J］.Int J Biochem Cell Biol，2002，34(11):1401-1414.

［4］ Hastings R，Qureshi M，Verma R，et al.Telomere attrition and accumulation of senescent cells in cultured human endothelial cells［J］.Cell Prolif，2004，37(4):317-324.

［5］ 李东霞，陈书艳.增龄对大鼠内皮功能的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19(3):243-243.

［6］ Sun C，Liu X，Qi L，et al.Modulation of vascular endothelial cell senescence by integrin β4［J］.J Cell Physiol，2010，225(3):673-681.

［7］ Bai B，Liang Y，Xu C，et al.Cyclin-dependent kinase 5-mediated hyperphosphorylation of sirtuin-1 contributes to the development of endothelial senescence and atherosclerosis［J］.Circulation，2012，126(6):729-740.

［8］ Chang MW，Grillari J，Mayrhofer C，et al.Comparison of early passage，senescent and hTERT immortalized endothelial cells［J］.Exp Cell Res，2005，309(1):121-136.

［9］ Rajapakse AG，Yepuri G，Carvas JM，et al.Hyperactive S6K1 mediates oxidative Stress and endo-thelial dysfunction in aging:inhibition by resveratrol［J］.PLoS One，2011，6(4):1-16.

［10］ Hampel B，Fortschegger K，Ressler S，et al.Increased expression of extracellular proteins as a hallmark of human endothelial cell in vitro senescence［J］.Exp Gerontol，2006，41(5):474-481.

［11］ Carracedo J，Buendía P，Merino A，et al.Klotho modulates the stress response in human senescent endothelial cells［J］.Mech Ageing Dev，2012，133(11-12):647-654.

［12］ Fleenor BS，Marshall KD，Rippe C，et al.Replicative aging induces endothelial to mesenchymal transition in human aortic endothelialcells:potentialrole of inflammation［J］.J Vasc Res，2012，49(1):59-64.

［13］ López-Otín C，Blasco MA，Partridge L，et al.The hallmarks ofaging ［J］.Cell， 2013，153(6):1194-1217.

［14］ Golden TR，Hinerfeld DA，Melov S.Oxidative stress and aging:beyond correlation［J］.Aging Cell，2002，1(2):117-123.

［15］ Harman D.The free radical theory of aging［J］.Antioxid Redox Signal，2003，5(5):557-561.

［16］ Magenta A，Cencioni C，Fasanaro P，et al.miR-200c is upregulated by oxidative stress and induces endothelial cell apoptosis and senescence via ZEB inhibition［J］.Cell Death Differ，2011，18(10):1628-1639.

［17］ Lappas M，Mitton A，Lim R，et al.SIRT1 is a novel regulator of key pathways of human labor［J］.Biol Reprod，2011，84(1):167-178.

［18］ Stein S，Schäfer N，Breitenstein A，et al.SIRT1 reduces endothelial activation without affecting vascular function in ApoE-/-mice［J］.Aging，2010，2(6):353-360.

［19］ Yeung F，Hoberg JE，Ramsey CS，et al.Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell survival by the sirt1 deacetylase［J］.Embo J，2004，23:2369-2380.

［20］ Donato AJ，Magerko KA，Lawson BR，et al.SIRT-1 and vascular Endothelial dysfunction with ageing in mice and humans［J］.J Physiol，2011，589(Pt18):4545-4554.

［21］ Maekawa Y，Ohishi M，Ikushima M，et al.Klotho protein diminishes endothelial apoptosis and senescence via a mitogen-activated kinase pathway［J］.Geriatr Gerontol Int，2011，11(4):510-516.

［22］ Maekawa Y，Ishikawa K，Yasuda O，et al.Klotho suppresses TNF-alpha-induced expression of adhesion molecules in the endothelium and attenuate NF-kappaB activation［J］.Endocrine，2009，35(3):341-346.

［23］ Higashi Y，Sukhanov S，Anwar A，et al.Aging，atherosclerosis，and IGF-1［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2012，67(6):626-639.

［24］ Higashi Y，Pandey A，Goodwin B，et al.Insulin-like growth factor-1 regulates glutathione peroxidase expression and activity in vascular endothelial cells:Implications for atheroprotective actions of insulin-like growth factor-1［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1832(3):391-399.

［25］ Calnan DR，Brunet A.The FoxO code［J］.Oncogene，2008，27(16):2276-2288.

［26］ Mortuza R，Chen S，Feng B，et al.High glucose induced alteration of SIRTs in endothelial cells causes rapid aging in a p300 and FOXO regulated pathway［J］.PLoS One，2013，8(1):e54514.

［27］ Oellerich MF，Potente M.FOXOs and sirtuins in vascular growth，maintenance，and aging［J］.Circ Res，2012，110(9):1238-1251.

［28］ 戴天耘，尹艳林，刘威威，等.SOCS3过表达细胞模型的建立［J］.同济大学学报:医学版，2012，33(4):1-6.

［29］ Yin Y，Liu W，Ji G，et al.The essential role of p38 MAPK in mediating the interplay of oxLDL and IL-10 in regulating endothelial cell apoptosis［J］.Eur J Cell Biol，2013，92(4-5):150-159.